鄭曉霞， 張丹參， 黃紅娜， 薛貴平

(河北北方學(xué)院藥理教研室，河北張家口075029)

大黃酚(chrysophanol，Chry)是在大黃、虎杖、何首烏等蓼科植物中提取的一種蒽醌類化合物，具有抗菌、興奮神經(jīng)、抗癌、止咳、抗衰老等藥理作用［1，2］。大黃酚屬于脂溶性化合物，在水中溶解度極小，生物利用度不高，限制了大黃酚在臨床中的應(yīng)用。本實驗旨在通過大黃酚-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物(Chry-HP-β-CD)制備工藝的研究以及對包合物的鑒定，為探索中藥單體有效成分的新劑型提供依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 儀器

Waters600高效液相色譜儀，美國waters公司;LabTech紫外分光光度計，北京萊博泰科儀器有限公司;XQM-0.4L變頻行星式球磨機，南京科析實驗儀器研究所;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠;85-2A數(shù)顯恒溫測速磁力攪拌器，金壇市金南儀器廠;JN-5200DT超聲波清洗機，寧波江南儀器廠。

1.2 材料

大黃酚(chrysophanol，含量≥98%)，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司;羥丙基-β-環(huán)糊精(hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HP-β-CD)，淄博千匯精細(xì)化工有限公司;大黃酚標(biāo)準(zhǔn)品(chrysophanol，批號:110796-200310)，中國藥品生物制品檢定所;甲醇(methanol)為色譜純，水為重蒸水，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 Chry-HP-β-CD含量測定方法的確定

2.1.1 色譜條件:選用Thermo BDS HYPERSIL C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)色譜柱;以甲醇-水(95∶5)為流動相;柱溫為30℃;檢測波長:254 nm;流速為 1.0 mL/min;進(jìn)樣量為 20 μL。

2.1.2 Chry對照品溶液的制備:精密稱取Chry標(biāo)準(zhǔn)品1.13 mg，以甲醇為溶劑溶解后定容到10 mL，搖勻得113 μg/mLChry對照品溶液，備用。

2.1.3 Chry-HP-β-CD供試品溶液的制備:取Chry-HP-β-CD適量，置于10 mL的量瓶中，加入甲醇，超聲20 min，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液即得。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:精密吸取Chry對照品溶液2、10、20、100、200、400、1 000 μL 至 2 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，使?jié)舛瘸蔀?.113、0.565、1.13、5.65、11.3、22.6、56.5 μg/mL 的一系列對照品溶液，進(jìn)樣，測定。以質(zhì)量濃度對峰面積做線性回歸，得回歸方程為:Y=44 504X+3 440.3，r=0.999 9，線性范圍為 0.113 ～56.5 μg/mL。

2.1.5 回收率試驗:精密稱取同一批Chry-HP-β-CD樣品9份，制成供試品溶液，取每份供試品溶液500 μL置于1 mL量瓶中，然后分別加入Chry對照品溶液(5.56 μg/mL)100、200、400 μL(每個平行 3份)后用甲醇稀釋至刻度，按上述色譜條件測定供試品與混合樣品的峰面積，分析含量，計算回收率，結(jié)果平均回收率為98.33%，RSD=1.54%。

2.2 Chry-HP-β-CD制備方法的選擇

包合物常用的制備方法有攪拌法、研磨法、超聲波法。分別采用3種方法制備包合物，以包合率為評價指標(biāo)，選擇最佳制備方法。

2.2.1 攪拌法:分別稱取規(guī)定量的Chry與HP-β-CD置于燒杯中，加入50%乙醇使二者溶解，置于磁力加熱攪拌器上，在30℃下，固定轉(zhuǎn)速為800 r/min，攪拌2 h后，靜置。將溶液真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，用0.45 μm的微孔濾膜過濾以除去未被包合的大黃酚，將濾液進(jìn)行真空干燥(30℃)，即得Chry-HP-β-CD固體粉末。

2.2.2 研磨法:按攪拌法中的處方比稱取Chry與HP-β-CD，加入適量50%乙醇溶解，倒入球磨罐中，在100 r/min的轉(zhuǎn)速下，研磨2 h后，靜置。將所得糊狀物減壓抽濾并用少量乙醇洗滌，真空干燥(30℃)后，得Chry-HP-β-CD固體粉末。

2.2.3 超聲波法:按攪拌法中的處方比稱取Chry與HP-β-CD于燒杯中，用50%乙醇溶解，置于超聲波清洗機中，功率為300W，超聲處理2 h后，靜置。將溶液真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，將濾液進(jìn)行真空干燥(30℃)，即得Chry-HP-β-CD固體粉末。

2.2.4 樣品分析:分別稱取用攪拌法、研磨法和超聲法制備的Chry-HP-β-CD適量置于10 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲20 min，再用甲醇稀釋至刻度，搖勻。按上述色譜條件進(jìn)行分析，根據(jù)外標(biāo)法計算Chry的含量，代入下式計算包合率。

包合率=(包合物中Chry的含量/Chry的投入量)×100%

3種制備方法制得的包合物中，大黃酚包合率分別是攪拌法為(63.83±0.21)%，研磨法為51.38±1.29)%，超聲法為(35.06±0.95)%。

結(jié)果表明，攪拌法所制備的Chry-HP-β-CD具有較高的包合率，因此選擇攪拌法作為制備Chry-HP-β-CD的方法。

2.3 正交試驗優(yōu)化Chry-HP-β-CD制備工藝

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道［3-5］，經(jīng)過單因素考察可知，影響HP-β-CD包合物的形成的因素主要有藥物與HP-β-CD的質(zhì)量比、乙醇的濃度、包合時間、包合溫度。以藥物與HP-β-CD的包合率為評價標(biāo)準(zhǔn)，采用三水平L9(34)正交表安排實驗，對 Chry-HP-β-CD的制備條件進(jìn)行優(yōu)選。因素水平見表1。

表1 因素水平表

按照正交設(shè)計的制備條件，采用攪拌法制備9種工藝的Chry-HP-β-CD，照2.1項下測定包合物的含量。

2.3.1 正交實驗結(jié)果 按上述L9(34)表對其進(jìn)行正交實驗，實驗結(jié)果以及方差分析分別見表2和表3。直觀分析以及方差分析分析表明，影響包合物包合率大小的因素為A＞B＞D＞C。通過方差分析可知，Chry與HP-β-CD的質(zhì)量比有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。根據(jù)工藝實際情況，最佳制備工藝為:A3B3C2D1，即Chry與 HP-β-CD 的質(zhì)量比為1∶60，乙醇的濃度為50%，包合時間為2 h，包合溫度為30℃。

Chry在水中的溶解度很低，若將Chry的醇溶液滴入到HP-β-CD的水溶液中會有黃色固體析出。鑒于Chry與HP-β-CD在乙醇中均有較好的溶解度，本實驗以50%乙醇作為溶劑，將二者都溶于其中。在包合過程中，疏水力是促進(jìn)包合的主要推動力，所以包合一般在水中或稀醇中進(jìn)行［6］。在進(jìn)行包合時藥物分子首先溶解在溶劑中，然后再與HP-β-CD形成包合物［7］。實驗結(jié)果表明，使用50%乙醇作為溶劑，可以完全溶解Chry分子，又不會明顯影響Chry-HP-β-CD的形成。延長包合時間可增加乙醇在攪拌過程中的揮發(fā)，乙醇揮發(fā)后有利于藥物由有機層進(jìn)入水層，進(jìn)一步提高包合率，所以最佳包合時間定為2 h。由于Chry熱穩(wěn)定性差以及藥物分子與HP-β-CD的結(jié)合通常是放熱反應(yīng)，所以升高溫度不利于包合過程，因此通過正交試驗確定包合溫度為30℃。

2.3.2 驗證試驗:以最佳制備工藝平行制備3批樣品，按照含量測定方法測定Chry的含量，3份Chry-HP-β-CD 包 合 率 分 別 為:64.65%、63.96%、63.72%，包合率平均值為:64.11%，RSD為0.75%，說明該工藝穩(wěn)定可行。

2.4 包合物的定性驗證

2.4.1 紫外分光光度法:采用紫外分光光度法，以吸收曲線與吸收峰的位置來判斷包合物形成的情況。掃描范圍:200～400 nm。掃描的溶液為:樣品1:Chry標(biāo)準(zhǔn)品的甲醇溶液;樣品2:Chry-HP-β-CD的水溶液;樣品3:Chry-HP-β-CD的供試品溶液(按2.1.3項下制得);樣品4:HP-β-CD的水溶液。取上述各少量樣品進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示，Chry包合前后，紫外吸收峰變化很大，包合后Chry在254 nm的特征吸收峰消失，說明Chry經(jīng)包合后進(jìn)入了HP-β-CD分子腔內(nèi)形成了穩(wěn)定的包合物。Chry-HP-β-CD經(jīng)甲醇提取后又重現(xiàn)包合前的吸收特征，說明包合物已經(jīng)形成。

圖1 Chry-HP-β-CD驗證紫外掃描光譜圖

2.4.2 薄層色譜法:取Chry標(biāo)準(zhǔn)品的甲醇溶液作為樣品1;Chry-HP-β-CD的水溶液為樣品2;Chry-HP-β-CD的供試品溶液為樣品3(按2.1.3項下制得);HP-β-CD的水溶液為樣品4。吸取上述4種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以苯-乙酸乙酯(8∶2)為展開劑展開，取出，晾干，放置在254 nm紫外燈下觀察。結(jié)果表明，樣品1與樣品3在同一位置顯相同顏色的黃色斑點，而樣品2與樣品4無此斑點顯示，說明Chry已被HP-β-CD包合，包合物已經(jīng)形成。

2.5 相溶解度研究

精密稱取HP-β-CD用蒸餾水配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1、2、5、10、15、20%的系列溶液，分別吸取 5 mL 置具塞試管中，均加入過量的Chry固體粉末，超聲10 min后置恒溫振蕩器(25℃)中，調(diào)整振蕩頻率為100 r/min，振蕩48h。使溶解達(dá)到平衡后，靜置，取上清液用0.45 μm的微孔濾膜過濾，濾液用高效液相法測定Chry的峰面積，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算Chry的濃度。

2.5.1 包合穩(wěn)定常數(shù)的測定:以HP-β-CD的濃度(mmol/L)為橫坐標(biāo)，Chry的濃度(mmol/L)為縱坐標(biāo)，繪制平衡相溶解度圖。結(jié)果線性回歸方程為:Y=3.599×10-4X+8.974×10-4(r=0.998 7)，表明隨著環(huán)糊精濃度的增加，藥物的溶解度呈線性提高，因此可以判定相溶解度曲線為AL型，說明Chry與HP-β-CD形成1∶1摩爾比的包合物。包合常數(shù)由公式:Kc=斜率/［截距(1-斜率)］求得，Kc越大，表明該藥物與環(huán)糊精的結(jié)合越穩(wěn)定，越容易形成包合物。經(jīng)計算Chry-HP-β-CD的Kc=401.19 L/mol，說明Chry可被HP-β-CD包合。

2.5.2 HP-β-CD對Chry的增溶作用:通過相溶解度的研究可知，隨著HP-β-CD比例的增大，對Chry的增溶作用逐漸增強。經(jīng)文獻(xiàn)查閱［8］，大黃酚在水中的固有溶解度為4.91×10-7mol/L(質(zhì)量濃度0.125 mg/L)，HP-β-CD對Chry的增溶作用見表4。當(dāng)HP-β-CD的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時，可使Chry溶解度增大102.66倍，說明用HP-β-CD包合Chry后，可有效地提高其在水中的溶解度。

表4 HP-β-CD對Chry的增溶作用

3 討論

大黃酚的藥理作用涉及改善脂肪代謝、抗炎、利尿、縮短凝血時間、保肝利膽、促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶及抗衰老等多方面作用［9-11］。大黃酚是具有酚羥基的蒽醌類化合物，脂溶性極高，利于藥物發(fā)揮作用，但其溶解度小沒有適宜的劑型供臨床應(yīng)用。HP-β-CD為β-環(huán)糊精(β-cyclodextrin，β-CD)的羥丙基衍生物，是一種低毒、安全、有效的藥物增溶劑［12］，作為注射用輔料被《美國藥典》收載。本研究利用包合技術(shù)，采用HP-β-CD為包合材料將大黃酚制成包合物，以提高其溶解度、拓展臨床應(yīng)用。

本研究證實攪拌法制備的Chry-HP-β-CD的藥物包合率較高且具有操作簡單、工藝條件易于控制的優(yōu)點。采用正交試驗對Chry-HP-β-CD的制備工藝進(jìn)行了研究，在最佳制備條件下Chry-HP-β-CD包合率達(dá)到64.11%，工藝穩(wěn)定可行。通用紫外光譜法、薄層色譜法與相溶解度法對Chry-HP-β-CD進(jìn)行驗證。研究表明，以HP-β-CD為包合材料，將大黃酚制成包合物后，起到了增加大黃酚溶解度的作用，為大黃酚新劑型的研究提供了依據(jù)。

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