楊德勇 田茂良 吳茂軍 呂方啟

(1.肥城礦業(yè)集團(tuán)中心醫(yī)院，山東 肥城 271608；2.泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 泰安 271000)

骨科創(chuàng)傷、尤其是撕脫傷病例的動脈斷裂或部分動脈缺如，多需要間置靜脈重建血液供應(yīng)。斷指再植手術(shù)中，通過動靜脈吻合利用靜脈供血使組織成活的手術(shù)方式。冠狀動脈旁路移植術(shù)(coronary artery bypass grafting,CABG)治療冠心病，以及血液透析采用的遠(yuǎn)端動-靜脈吻合等，使我們面對越來越多的靜脈動脈化的問題。目前自體靜脈仍是主要的血管橋移植來源，研究發(fā)現(xiàn)“靜脈橋”隨時間的推移可發(fā)生退化、進(jìn)行性狹窄、血栓形成，并最終發(fā)生閉塞。故術(shù)后如何保持移植血管的通暢率是臨床上亟待解決的問題。有鑒于此，我們對兔頸外靜脈動脈化后血管橋內(nèi)膜及中膜改變進(jìn)行了研究，采用辛伐他汀和左旋精氨酸兩種藥物進(jìn)行保護(hù)，以了解靜脈橋移植后狹窄發(fā)生的機(jī)制并提供有效的干預(yù)措施。為臨床預(yù)防自體移植靜脈再狹窄提供一新的思路和方法。

1 資料與方法

1.1試驗(yàn)對象

健康新西蘭大白兔50只，雌雄不拘，體重2.4±0.3 kg(由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供)，隨機(jī)分成兩組：辛伐他汀聯(lián)合左旋精氨酸實(shí)驗(yàn)組及生理鹽水對照組，每組25只。并設(shè)定自身對側(cè)未移植頸外靜脈作為正常靜脈參照。生理鹽水對照組：術(shù)前三日始，經(jīng)胃灌注生理鹽水10 ml，每日一次，直至術(shù)后取材。實(shí)驗(yàn)組：術(shù)前三日始，經(jīng)胃灌注含辛伐他汀生理鹽水(10 ml+辛伐他汀10 mg/kg)，經(jīng)耳緣靜脈給予左旋精氨酸(100 mg/kg)每日一次，直至術(shù)后取材。

1.2頸外靜脈移植至股動脈的動物模型的建立

術(shù)前禁食4小時， 不禁飲。實(shí)驗(yàn)兔耳緣靜脈內(nèi)注射戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉。麻醉成功后全身肝素化(2 mg/kg耳緣靜脈注射)。碘伏消毒皮膚，取股內(nèi)側(cè)縱切口，長約5 cm，切開皮膚及皮下結(jié)締組織，在前后肌群間隙內(nèi)分離股動靜脈，游離股動脈長約2～3 cm。在動脈下面引過1根絲線備用。取頸正中切口，長約5 cm，在胸鎖乳突肌外緣尋找到頸外靜脈，沿血管走行方向?qū)㈩i外靜脈輕輕分離，上至上頜外靜脈與上頜內(nèi)靜脈分叉處，下至胸骨水平，游離頸外靜脈。取其主干約4.0 cm，兩端予以結(jié)扎。離斷所取靜脈段，留取0.5 cm作為正常靜脈參照，用生理鹽水(含肝素5000 U/L)沖洗管腔，并置于同樣液體中常溫保存。股動脈遠(yuǎn)近兩端置無創(chuàng)血管夾(哈巴狗)，用冠脈刀分別于動脈兩端前壁剪開約2.5 mm，相距約2.0 cm。2.5倍手術(shù)放大鏡下修剪靜脈兩斷端，分別與剪開之動脈壁用7-0Prolene線連續(xù)作端側(cè)吻合。先吻合近端，后吻合遠(yuǎn)端，吻合完畢后，開放近心端動脈夾，從未打結(jié)的遠(yuǎn)端吻合口排氣及沖出血凝塊，打結(jié)完畢后開放遠(yuǎn)端動脈夾。然后結(jié)扎兩吻合口之間股動脈。吻合后靜脈橋充盈明顯，觸之可有動脈搏動。術(shù)后處理：常規(guī)普通飼料飼養(yǎng)，手術(shù)當(dāng)天開始，每日阿司匹林5 mg/kg混入飼料抗凝，肌肉注射青霉素(30 ku/kg)預(yù)防感染，連續(xù)3天。

1.3標(biāo)本的采集

手術(shù)后4周采用相同方法麻醉，沿原切口分離、切取移植血管，分成兩段，一段置于用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋待檢，備光鏡檢查；另一段靜脈沿管腔縱形切開，生理鹽水洗凈置于5%的戍二醛固定送檢，備掃描電鏡檢查。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS12.0統(tǒng)計分析軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用方差分析，相關(guān)分析采用直線回歸。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1光鏡觀察：移植4周后的各組血管的內(nèi)膜中膜厚度分別為：正常組(51.15±2.64)、實(shí)驗(yàn)組組(74.020±2.15)、對照組(98.54±4.34)，各組之間P=0.000，均小于0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義(見表1)。

表1 動脈化靜脈血管厚度變化

注：與正常組比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05

2.2掃描電鏡形態(tài)學(xué)觀察

正常移植靜脈：內(nèi)膜排列較緊密，細(xì)胞連接成“鵝卵石”樣，內(nèi)膜光滑、完整，可見順血流方向規(guī)則排列的縱嵴，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞連接緊密平整。

對照組：內(nèi)膜表面較清潔，內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋不完全，較多部位無內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)彈力膜斷裂，細(xì)胞連接破壞，呈“溝樣”改變。彈力纖維或中膜層暴露或斷裂，可見少量血小板吸附。

實(shí)驗(yàn)組：內(nèi)膜表面光滑，細(xì)胞飽滿、連接緊密，內(nèi)皮細(xì)胞排列成“鵝卵石”樣，未見明顯細(xì)胞剝脫現(xiàn)象，僅見少部分區(qū)域的細(xì)胞連接處斷裂，偶見少量血小板吸附。

2.3組織形態(tài)學(xué)觀察及新生內(nèi)膜面積、厚度測定

正常頸靜脈：內(nèi)膜僅是單層內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋，中膜很薄，由2～3層平滑肌細(xì)胞及膠原組成。

術(shù)后4周，實(shí)驗(yàn)組和對照組靜脈橋均可見血管內(nèi)膜受損，局部有附壁血栓，并可見薄層新生內(nèi)膜形成。對照組內(nèi)膜增生更為明顯。實(shí)驗(yàn)組內(nèi)膜于移植術(shù)后增厚，但與對照組比較，內(nèi)膜增生受到明顯抑制，新生內(nèi)膜厚度及面積與對照組相比差異均有顯著性(P<0.0 5和P<0.0 1)。見表2。

表2 兩組移植靜脈不同時間點(diǎn)新生內(nèi)膜厚度及面積的變化

注：與對照組同期相比*P<0.05。

3 討 論

目前自體靜脈仍是臨床上冠狀動脈旁路術(shù)和修復(fù)中小動脈(直徑<6 mm)缺損的首選材料[1]，但由于靜脈生理功能和結(jié)構(gòu)與動脈存在差異，靜脈移植于動脈系統(tǒng)后在動脈壓力和動脈流體力學(xué)環(huán)境下往往出現(xiàn)內(nèi)膜過度增厚，影響遠(yuǎn)期通暢率。Raja[2]報道術(shù)后1年移植靜脈血管堵塞發(fā)生率為15%，10年后上升至50%。早期的血栓形成、內(nèi)膜增生以及后期的粥樣硬化被認(rèn)為是靜脈橋狹窄的主要原因，內(nèi)膜增生被認(rèn)為移植靜脈再狹窄病變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[3]，而通過調(diào)整血管壁平滑肌細(xì)胞增殖與凋亡的動態(tài)平衡可以有效控制內(nèi)膜增生[4]，因此抑制平滑肌細(xì)胞過度增生、誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞凋亡，一直是防治移植靜脈再狹窄努力的方向[5]。

血管內(nèi)膜增生的過程有三個高峰：(1)血管平滑肌細(xì)胞在中膜增生。內(nèi)皮細(xì)胞損傷后即誘發(fā)血栓形成，在血栓形成的24h內(nèi)血管平滑肌細(xì)胞即開始增生。(2)血管平滑肌細(xì)胞由中膜遷移至內(nèi)膜。血管損傷后釋放酶類降解胞外基質(zhì)，血管平滑肌細(xì)胞于血管損傷后第4天即開始由中膜向內(nèi)膜游移，持續(xù)4周。最近有研究顯示外膜的成肌纖維細(xì)胞也能增生并向內(nèi)膜游移[6]。(3)內(nèi)膜顯著增厚，血管平滑肌細(xì)胞增殖、游移以及大量胞外基質(zhì)的合成使內(nèi)膜迅速增厚。轉(zhuǎn)型生長因子-β(TGF-β)和血小板源性生長因子(PDGF)等可刺激血管平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生胞外基質(zhì)。刺激血管平滑肌細(xì)胞增殖的因子亦可使其合成胞外基質(zhì)。觀察不同時間段血管橋病理切片，見術(shù)后1周靜脈橋血管壁增厚，內(nèi)膜及中膜均明顯增厚，中膜彈性纖維增多；術(shù)后2～4周內(nèi)膜增厚達(dá)高峰，且不均勻，中膜、內(nèi)膜均有增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)陽性表達(dá)。內(nèi)膜出現(xiàn)α-actin陽性細(xì)胞表達(dá)，說明中膜平滑肌細(xì)胞增生、遷移至內(nèi)膜，參與新內(nèi)膜形成，使內(nèi)膜增厚。此期血管內(nèi)膜結(jié)構(gòu)疏松，可能是平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變?yōu)榉置谛停置诖罅考?xì)胞外基質(zhì)；術(shù)后4周增生內(nèi)膜中可見大量泡沫細(xì)胞，這可能是晚期形成血管粥樣硬化的潛在因素。術(shù)后8周血管內(nèi)膜結(jié)構(gòu)致密，中膜彈性纖維明顯增多，排列整齊。另外術(shù)后1周中膜和新生內(nèi)膜可見少量凋亡細(xì)胞，術(shù)后4周凋亡細(xì)胞增逐步達(dá)到高峰[7,8]。移植后靜脈壁重構(gòu)過程是為了適應(yīng)動脈血流動力學(xué)環(huán)境，是在多細(xì)胞因子作用以及基因控制性表達(dá)等多途徑反饋機(jī)制調(diào)節(jié)下進(jìn)行[9]，本研究采用兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用，有效抑制了“橋血管”的內(nèi)膜增生。

辛伐他汀屬他汀類藥物即3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑(HCRI)一種。HCRI為一類作用較強(qiáng)的調(diào)整血脂藥物，可減少膽固醇的生物合成，加強(qiáng)血液低密度脂蛋白(LDL)及其前體的清除。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)他汀類藥物還具有一系列非降脂作用。研究表明HCRI能抑制多種細(xì)胞增殖，包括人、猿、豬的血管平滑肌細(xì)胞(vascular smoothmuscle cell,VSMC)、內(nèi)皮細(xì)胞，鼠脾淋巴細(xì)胞，人外周血淋巴細(xì)胞等，且這種作用獨(dú)立于其調(diào)整血脂的作用[10]。利用低密度脂蛋白受體缺陷性小鼠研究表明，辛伐他汀可減少血管成形術(shù)后平滑肌細(xì)胞(SMC)增殖而不影響血漿脂蛋白濃度[11]。Indolfi C等[12]研究發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可通過抑制血管SMC增殖，而減輕兔動脈損傷模型中的內(nèi)膜增生程度。另有研究表明，他汀類藥物可以增強(qiáng)粥樣斑塊的穩(wěn)定性，從而降低心血管臨床事件發(fā)生率，此作用非依賴于其降脂特性。進(jìn)一步動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，他汀類藥物可以減少動脈粥樣斑塊內(nèi)細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases MMPs)，抑制了斑塊纖維帽結(jié)構(gòu)的降解，增加其穩(wěn)定性[13]。近期細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀、西立伐他汀、洛伐他汀等他汀類藥物都可降低血管壁SMC的MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9的分泌及活性[14]。由于MMPs尤其是MMP-2和MMP-9在自體移植靜脈內(nèi)膜增生形成過程中發(fā)揮著重要作用，推測他汀類藥物可能對靜脈內(nèi)膜增生有一定的抑制作用。Porter等[15]體外研究證實(shí)，0.5～5μmol/L辛伐他汀顯著減少人大隱靜脈平滑肌細(xì)胞MMP-9分泌，使SMC遷移能力下降，從而減輕了培養(yǎng)靜脈的內(nèi)膜增生程度。然而，辛伐他汀對自體移植靜脈SMC增殖的影響尚未見報道。

近來研究發(fā)現(xiàn)左旋精氨酸有改善心、腦、肺、胰等組織缺血再灌注超微結(jié)構(gòu)損傷的作用[16]。推測與下列因素有關(guān) (1)在缺血再灌注時擴(kuò)張血管，減少炎性遞質(zhì)釋放，減少再灌注損傷，改善局部血流，平衡氧和能量代謝。(2)L-精氨酸為NO合成的前體物質(zhì)，NO作為重要的信使分子和效應(yīng)分子，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，不僅對血管有強(qiáng)效擴(kuò)張作用，還抑制血管內(nèi)皮和血管壁平滑肌細(xì)胞的增殖與移行，有利于改善血管的重構(gòu)，同時抑制血小板的聚集和中性粒細(xì)胞的粘附，對減少血管阻力，維持血管暢通起著關(guān)鍵性的作用。根據(jù)其作用機(jī)制對移植橋靜脈內(nèi)膜增生有抑制作用，減少進(jìn)行性狹窄和血栓形成，對移植靜脈的預(yù)后發(fā)揮重要作用。

本實(shí)驗(yàn)采用兔頸外靜脈作為橋血管端-側(cè)吻合于股動脈制備靜脈動脈化模型，在圍手術(shù)期應(yīng)用上述兩種藥物干預(yù)，與對照組相比，統(tǒng)計學(xué)處理有顯著差異，說明能減輕術(shù)后移植血管的缺血再灌注損傷、抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的增殖和移行，抑制血小板的聚集和中性粒細(xì)胞的粘附，對減少血管阻力、維持血管通暢起著關(guān)鍵性的作用。本實(shí)驗(yàn)為提高自體移植靜脈的通暢率提供了一定的臨床依據(jù)。

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