張 強(qiáng) 高 巖 王新立 穆玉恕 王宗福 高 松

(1. 泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 泰安 271000；2. 泰安市中醫(yī)醫(yī)院，山東 泰安 271000)

食管癌(Esophageal carcinoma， EC)是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一?；熥鳛槿硇灾委熓侄卧谑彻馨┑闹委熤芯哂胁豢商娲淖饔?。但由于在食管癌組織中存在多種耐藥基因的擴(kuò)增及臨床經(jīng)驗(yàn)用藥等原因使化療不可避免地存在盲目性及隨意性，造成了食管癌化療效果欠佳，繼發(fā)性耐藥及不必要的毒副作用。 因此，腫瘤化療的敏感性研究已成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，以抗癌藥物個(gè)體化治療為目的的MTT藥敏實(shí)驗(yàn)愈來愈受到重視。通過藥敏實(shí)驗(yàn)，在化療實(shí)施前篩選出有效的藥物，對于實(shí)現(xiàn)腫瘤化療的合理化、個(gè)體化用藥有實(shí)用價(jià)值。

Livin是新近發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白家族(inhibi torofapoptosisprotein,IAP)成員之一,是從人類基因組cDNA文庫中克隆得到的一種蛋白質(zhì),同時(shí)也被命名為ml IAP、KIAP。研究表明Livin在正常成人組織中不表達(dá)或低表達(dá),在多數(shù)腫瘤組織中高表達(dá),如黑色素瘤、乳癌、宮頸癌、膀胱癌、白血病以及淋巴瘤等。新近研究表明Livin可能還與腫瘤的化療藥物的耐藥性有關(guān)[1]，本實(shí)驗(yàn)著重研究原代食管癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性，并進(jìn)一步探討其敏感性與食管癌組織中Livin基因表達(dá)的關(guān)系，為食管癌的臨床化療提供個(gè)體化用藥的實(shí)驗(yàn)資料和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1臨床資料 收集泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2007年12月至2008年12月外科手術(shù)切除的80例食管癌標(biāo)本。所有病例均經(jīng)胃鏡活檢病理證實(shí)且術(shù)前未行化療、放療。其中男性52例，女性28例，年齡46歲-78歲，中位年齡56歲。

1.2材料 RPMI-1640完全培養(yǎng)液GIBCO公司產(chǎn)品，10%胎牛血清、MTT 美國Sigma公司產(chǎn)品，異丙醇 蘇州正興化工研究院產(chǎn)品。紫杉醇(taxol, Tax) 四川太極制藥有限公司產(chǎn)品，順鉑(cisplatin，DDP)中國山東齊魯制藥廠產(chǎn)品，阿霉素(adriamycin ，ADM)中國山東新華制藥廠產(chǎn)品，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)中國上海華聯(lián)制藥有限公司產(chǎn)品，絲裂霉素(fitomucin ，MMC)中國黃石美升藥業(yè)有險(xiǎn)公司產(chǎn)品。Livin兔抗人多克隆抗體，SP試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)公司。

1.3取材

80例食管癌組織均來自泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院外科手術(shù)切除標(biāo)本。從瘤體生長活躍、無壞死變性的部位取材，用酸性離子水反復(fù)沖洗，外觀半透明，呈新鮮魚肉狀，有質(zhì)感和彈性。置于預(yù)先準(zhǔn)備好的裝有Hanks液的無菌凍存管中。

1.4腫瘤細(xì)胞懸液制備

在超凈工作臺上，食管癌組織用滅菌PBS沖洗3遍，無菌剪刀剪成糊狀，200目銅網(wǎng)研磨過濾，過濾后以3000r/min離心10min，去掉上清后用Hanks液漂洗二次后，用臺盼藍(lán)染色記數(shù)活細(xì)胞數(shù)大于95%，用10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液重懸，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整單細(xì)胞懸液至活細(xì)胞濃度 (2～3)×105 個(gè)/ml。

1.5MTT藥物敏感試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)分為3組，(1)用藥組：取分離純化后的單細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板，每孔180ul，分別加入藥物終濃度為10倍血漿峰值濃度(見表1)的紫杉醇( Tax)、順鉑(DDP)、阿霉素(ADM)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、絲裂霉素(MMC)，每組藥物設(shè)4個(gè)復(fù)孔；(2)對照組：每孔加入分離純化后的單細(xì)胞懸液180ul，不加藥物；(3)空白組：加180ul培養(yǎng)液，無培養(yǎng)細(xì)胞；置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)后，加入5mg/m l的MTT10ul于各孔，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。加入0.04N鹽酸異丙醇100ul/孔充分溶解所生成的甲瓚，靜止10分鐘，通過酶標(biāo)儀在570nm波長檢測光密度值(OD值)的變化。取4復(fù)孔OD值的平均值作為細(xì)胞在此藥物組的平均OD值。腫瘤細(xì)胞抑制率=(對照組OD值-用藥組平均OD值)/(對照孔平均OD值-空白組OD值)×100%。判斷標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤細(xì)胞抑制率>5O%為高度敏感，30～50%為中度敏感，<30%為不敏感,既為耐藥。

1.6免疫組化實(shí)驗(yàn)

應(yīng)用免疫組化SP法檢測標(biāo)本中l(wèi)ivin蛋白的表達(dá)。嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。對照設(shè)置：用已知PTEN陽性的結(jié)腸粘膜染色結(jié)果為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。

結(jié)果判定：根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[2]制定，采用雙盲法對每張切片在高倍鏡(×400)下計(jì)數(shù)5個(gè)視野。以染色強(qiáng)度分別計(jì)為：0分為細(xì)胞核和/或細(xì)胞漿內(nèi)無染色顆粒；1分為細(xì)胞核和/或細(xì)胞漿內(nèi)有黃染的細(xì)小的顆粒；2分為細(xì)胞核和/或細(xì)胞漿內(nèi)有較多的黃色顆粒；3分為細(xì)胞核和/或細(xì)胞漿內(nèi)有粗大的棕黃色顆粒。再以染色陽性細(xì)胞比例分別計(jì)為：0分為無陽性細(xì)胞；1分為陽性細(xì)胞數(shù)為1～25%；2分為陽性細(xì)胞數(shù)為26～50%；3分為陽性細(xì)胞數(shù)為51～100%。最后免疫組化染色結(jié)果以兩項(xiàng)相加得分 > 2分為陽性，0～2分為“-”，3～4分為“+”，4～5分為……

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)包進(jìn)行分析，用χ2檢驗(yàn)，連續(xù)性校正χ2檢驗(yàn)和Fisher精確概率計(jì)算法進(jìn)行計(jì)數(shù)資料的顯著性檢驗(yàn)。P< 0.05視為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié) 果

2.1化療藥物作用后原代食管癌細(xì)胞的體外抑制率

MTT檢測結(jié)果提示，不同個(gè)體食管癌細(xì)胞對化療藥物的敏感率各不相同；五組藥物之間敏感性差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中TAX、MMC 及5-FU之間敏感性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值均大于0.05；但TAX、MMC 及5-FU與ADM及DDP之間敏感性差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),前者明顯高于后者； ADM敏感性明顯低于DDP，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對臨床用藥有指導(dǎo)作用(表1)。

表1 食管癌組織MTT藥敏檢測結(jié)果(例，%)

注：H=14.92,P=0.005，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

﹡與ADM組相比，q值=3.64，P<0.05; ﹡與DDP組相比，q值=4.56，P<0.01; ﹡﹡與ADM組相比，q值=4.39，P<0.01; △與ADM組相比，q值=3.65，P<0.01; △與5-FU組相比，q值=5.36，P<0.01; #與ADM組相比，q值=3.77，P<0.05; #與DDP組相比，q值=4.48，P<0.05;

2.2食管癌組織中Livin的表達(dá)與化療藥物體外抑制率的關(guān)系

將MTT檢測結(jié)果中抑制率≥30%者判為敏感，而<30%者判為耐藥。Livin陽性表達(dá)與5-FU及DDP的體外耐藥性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.010、P=0.031)，P值均小于0.05；而與TAX、ADM及MMC的體外耐藥性無關(guān)(P>0.05)。(表2)

表2 食管癌組織中Livin表達(dá)結(jié)果與MTT藥敏的關(guān)系

圖1 原代胃癌細(xì)胞化療藥物作用后胞漿、胞核固縮，胞內(nèi)出現(xiàn)空泡 ×200

圖2 食管鱗癌中Livin胞核，胞漿陽性表達(dá) ×200

3 討 論

食管癌是我國常見惡性腫瘤之一。其五年生存率仍在20%以下，嚴(yán)重威脅著我國高發(fā)區(qū)人民的生命?；熥鳛槿硇灾委熓侄卧谑彻馨┑闹委熤芯哂胁豢商娲淖饔?，尤其對已處于轉(zhuǎn)移和播散期的食管癌患者，有效化療是延長生存期必不可少的方法。但由于腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的差異以及對化療藥物產(chǎn)生耐藥等原因，造成了食管癌化療效果欠佳。

Livin 是凋亡蛋白抑制子 (inhibitor of apoptosis protein,IAP) 家族的重要成員，Livin的結(jié)構(gòu)比較特殊， 它由 α和 β亞基組成， 這兩個(gè)亞基各有一個(gè)(baculovirus inhibitory repeat,BIR) 序列， 完整的 Livin結(jié)構(gòu)是一種能抑制細(xì)胞凋亡的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)， 它能與半胱氨酸- 天冬氨酸蛋白酶 (Caspase)-3,7,9 結(jié)合， 抑制 Caspase 活性， 阻斷死亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。由于 Livin 能抑制Caspase 的活性， 因而腫瘤細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)的 Livin 在腫瘤細(xì)胞耐受藥物誘導(dǎo)凋亡過程中起著關(guān)鍵性作用。[3]

劉凌翔等研究發(fā)現(xiàn)， DDP 作用于 BGC-283， 早期表現(xiàn)為 Livin 表達(dá)的抑制， 但隨著時(shí)間的延長， Livin 表達(dá)出現(xiàn)明顯上調(diào)[1]。可能其早期通過下調(diào)局灶連接 FAK 蛋白和 ECM整合蛋白介導(dǎo)的抗凋亡途徑， 來抑制IAPS的表達(dá)[4]，而在 DDP 作用的晚期， 隨著 NF-κB 表達(dá)的逐漸增強(qiáng)， 最終又使 IAPS 上調(diào)， 抑制了凋亡,使細(xì)胞產(chǎn)生耐藥[5]]。這與既往研究中多數(shù)細(xì)胞毒性藥物(紫杉醇、順鉑和阿霉素等) 使 Survivin 上調(diào)[6]的結(jié)論一致.本研究結(jié)果表明Livin陽性表達(dá)者與DDP耐藥有關(guān)(P<0.05)，與上述研究結(jié)果一致,本研究還發(fā)現(xiàn)Livin陽性表達(dá)者與5-FU耐藥有關(guān)(P<0.05),提示Livin可作為食管癌原發(fā)性耐藥標(biāo)志之一。本研究還發(fā)現(xiàn)食管癌對不同的化療藥物敏感性差異很大，以MMC、TAX及5-FU好，而傳統(tǒng)的、經(jīng)驗(yàn)的抗癌藥物ADM及DDP的高度敏感率分別只有33.7%,27.5%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果對食管癌的臨床化療用藥有指導(dǎo)作用。

總之,Livin 在腫瘤細(xì)胞抗凋亡誘導(dǎo)和保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受化學(xué)藥物毒性作用的機(jī)制， 還是一個(gè)未闡明的科學(xué)問題。 但是由于腫瘤細(xì)胞內(nèi)Livin 的過表達(dá)， 導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞對 TRAIL、化學(xué)藥物耐受， 這些是臨床上采用細(xì)胞因子和化學(xué)藥物治療腫瘤時(shí)要面臨的腫瘤耐藥問題。所以應(yīng)該把 Livin當(dāng)成新的靶標(biāo)， 通過靶向性抑制 Livin 表達(dá)， 解除Livin 對 Caspase 的抑制， 使凋亡信號通路通暢， 從而增加癌細(xì)胞對化學(xué)藥物的敏感， 這些研究將開辟一條新的安全有效治療腫瘤的途徑。

[1] 劉凌翔， 朱華云，張錦英，等；兩種鉑類藥物對人胃癌細(xì)胞 Livin 基因表達(dá)的影響[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)( 自然科學(xué)版),2007：27(5)415-418.

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[3] 李孟森 周 升 李 剛等;Livin 基因過表達(dá)與腫瘤耐藥的研究進(jìn)展[J].中國藥物與臨床, 2006,6(2)85-87.

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