孫庭閣 趙瑞萌 張 玲

(泰山醫(yī)學院生物科學系，山東 泰安 271016)

泰山黃精(PolygonatumsibiricumRed)屬百合科多年生草本植物，藥用部分為根莖。因其獨特的生長環(huán)境和氣候條件在全國多種黃精中被譽為上品[1]。本實驗所用的泰山黃精為樓臺黃精，又名重樓黃精或雞頭黃精，為泰山正品[2]。黃精以根莖入藥，具有補氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺、益腎之功能。臨床上用于治療脾胃虛弱、體倦乏力、口干食少、肺虛燥咳、精血不足及內熱消渴等癥[3]。研究表明，泰山黃精主要含多糖、低聚糖、黃精皂苷、氨基酸、黃酮及微量元素等，其中黃精多糖是黃精化學組成的一個重要部分[4]?，F代藥理研究表明, 黃精多糖具有多種生物學功能[5]。由于多糖不溶于60%以上乙醇，也不溶于氯仿和正丁醇，所以傳統(tǒng)上用熱水提取多糖，乙醇沉淀除去部分醇溶性雜質[6]?？紤]到熱水浸提多糖影響因素較多，所以本實驗采用正交實驗比較了不同的提取次數、提取溫度、浸提時間、固液比對黃精多糖提取率的影響，以期篩選出一種高效、經濟的提取方法，為實際生產提供理論依據。

1 材 料

1.1 儀器

AB265-S 61G/220電子分析天平(瑞士，梅特勒-托利多)； DJ-500A電子天平( 亞太公司)；旋轉蒸發(fā)儀(德國BMH)；UV=755B紫外-可見分光光度計(江蘇省宜興市儀器儀表總廠)；離心機(上海安亭科學儀器廠)；KQ-600DB數控大型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；CHN-86801奧立龍酸度計。

1.2 材料與試劑

黃精采自泰山，經泰山醫(yī)學院中藥教研室鑒定為泰山正品雞頭黃精(PolygonatumsibiricumRed)。苯酚、濃硫酸、葡萄糖、無水乙醇、蒸餾水、氯仿、正丁醇等均為分析純。

2 方法與結果

2.1 試劑的配制

2.1.1NaOH溶液的配制 用電子分析天平精密稱取1.0000 g、2.0000 g、3.0000 g、10.0000 g固體氫氧化鈉，用蒸餾水充分溶解后，置容量瓶中定容至100 ml,顛倒混勻，即得1%、2%、3%、10%NaOH溶液。

2.1.2Sevag試劑的配制 氯仿與正丁醇按1︰4比例混合即得(現用現配)。

2.1.3苯酚溶液的配制 取適量苯酚(餾分好的),取此餾分15.00 g,用蒸餾水充分溶解后，置250 ml容量瓶中, 定容至刻度，搖勻，置于棕色瓶中,冷藏備用。

2.1.4葡萄糖標準品溶液的配制 稱取105℃干燥至恒重(前后兩次質量差小于2 mg)的葡萄糖標準品0.1002 g, 置于100 ml 容量瓶中, 加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，取10 ml稀釋到50 ml作為標準使用液備用。

2.2 標準曲線的繪制

精密量取上述配制好的葡萄糖標準溶液0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 ml，分別置于10 ml具塞試管中，依次加蒸餾水使其總體積均達到2 ml, 然后依次加入6% 苯酚溶液1.0 ml，充分混勻, 迅速加入5.0 ml 濃硫酸(加濃硫酸時, 勿沿壁加入, 應將移液管口懸于試管口, 使?jié)饬蛩岽怪睕_入液面),混勻，放置5 min，沸水浴加熱15 min，取出后冷卻至室溫。另以2.0 ml蒸餾水作為空白對照，所有操作均與上述相同，測定490 nm 下吸光度。以吸光度為縱坐標, 葡萄糖濃度為橫坐標， 繪制標準曲線，得回歸方程：A = 0.0136C, R2=0.9842。

2.3 黃精多糖的提取工藝流程

鮮黃精根塊洗凈烘干至恒重后粉碎，分別過20，60，100目篩→加入適量蒸餾水→適宜溫度提取兩次→合并提取液→過濾→離心→旋轉蒸發(fā)濃縮→Sevag試劑脫蛋白→活性炭脫色→濃縮→乙醇沉淀→洗滌沉淀→真空干燥黃精多糖。

2.4 換算因子的測定

準確稱取已干燥至恒重的自制黃精多糖0.1000 g,置于50 ml干凈燒杯中，用少量蒸餾水溶解，完全轉入100 ml容量瓶中，最后用蒸餾水定容，再準確吸取該溶液1 ml于10 ml容量瓶中，蒸餾水定容，混勻用作儲備液。精密移取該溶液2.0 ml，按標準曲線的方法測定吸光度，計算多糖中葡萄糖的濃度，按公式計算換算因子：F=W/(C·D)。W為多糖質量(mg)，C為多糖中葡萄糖的濃度(mg/ml)，D為多糖的稀釋倍數。

2.5 多糖含量的測定

精密吸取黃精多糖樣品溶液1 ml，按照測定葡萄糖標準溶液同樣的方法測吸光度，根據標準曲線和換算因子，按下公式計算樣品中多糖的百分含量：多糖含量(%)=C·D·F/W，公式中C為供試液中葡萄糖的濃度(mg/ml)，D代表供試液中多糖的稀釋倍數，F為換算因子，W為供試品的質量(mg)。

2.6 正交實驗設計

為了選取提取黃精多糖的最佳條件，根據預實驗結果，選取提取溫度、熱水浸提時間、固液比和提取次數4項為考察因素，各取3個水平，進行正交實驗設計(43)，不考慮各因素間的相互影響。因素-水平設計見表1。

表1 水提醇析法提取黃精多糖的正交實驗表

2.7 回收率測定

精密稱取黃精干粉三份，每份5 g，依次加入10、20、30 mg葡萄糖，按照上述篩選的最佳條件提取多糖，并按照測定標準葡萄糖溶液的方法測定多糖含量，根據公式計算加標回收率：P=(Xi-X0)/m×100%，公式中P為加入的標準物質的回收率，m為加入標準物質的量，Xi為加標樣品的測定值，X0為未知樣品的測定值。計算得平均回收率97.5%，RSD為2.07%。

2.8 顯色穩(wěn)定性測定

取黃精多糖供試溶液, 依法顯色后, 在30、60、90、120 min測定其吸光度，結果表明，在120 min內測定，多糖溶液顯色穩(wěn)定，吸光度變化不大。

2.9 正交實驗提取黃精多糖的測定結果 見表2。

表2 正交實驗提取黃精的測定結果

注：因素主次順序為ACDB，最佳條件為A2B3C1D2

從表2的直觀分析可以看出，極值R反應了4個因素對多糖提取含量的影響RA>RC>RD>RB,即熱水浸提黃精多糖的因素主次關系為ACDB，最佳條件為A2B3C1D2。即因素主次關系：提取溫度>料液比>提取次數>時間，最佳條件為溫度80℃，時間120 min, 料液比1︰15, 提取次數2次。

3 討 論

熱水浸提是提取分離黃精多糖的傳統(tǒng)方法, 其影響因素較多，主要有提取時間、水提溫度、提取次數及固液比等，正交實驗結果表明，熱水溫度和固液比是影響水提醇析法提取黃精多糖的主要因素，分別達到了顯著性水平，提取時間影響相對較小，即因素主次關系：提取溫度>固液比>提取次數>提取時間。在本實驗條件下，熱水浸提黃精多糖的最佳條件為溫度80℃，時間120 min, 料液比1︰15, 提取次數2次。

[1] 李元富，張義濤，劉道富.泰山藥用植物[M].中國醫(yī)藥科技出版社,1996,(10):245.

[2] 畢研文，宮俊華，楊永恒.泰山黃精藥用價值和栽培技術[J].安徽農學通報，2006,12(8):86-87.

[3] 國家藥典委員會.中國藥典2000年版(一部)[S].北京:化學工業(yè)出版社, 2000:252.

[4] 中華本草編委會.中華本草第八卷[M].上海：上?？萍汲霭嫔?， 1999：142.

[5] 石林, 蒙義文，李偉.黃精及黃精多糖的藥理研究[J].天然產物研究與開發(fā)，1999.11(3)： 67-71.

[6] 楊文遠，郭偉，王天勇.寧夏黃精中黃精多糖的分離提取和測定[J].寧夏大學學報,1997,18 (2):359-360.