徐曉燕 張志港 辛曉明 王 浩

(1.泰山醫(yī)學院藥理學教研室，山東 泰安 271016； 2. 泰山醫(yī)學院2004級藥學本科，山東 泰安 271016)

牛膝(AchyranthesbidentataBL)又名百倍，雞膠骨，為莧科多年生草本植物，根為藥用部分，是我國的一種傳統(tǒng)中藥。其味苦、酸，性平，入肝腎經(jīng)。中華人民共和國藥典(2005年版)上記載：牛膝有補肝腎、強筋骨、逐瘀通經(jīng)、引血下行之功效[1]。牛膝根含三萜皂甙、甾體類、糖類、氨基酸、生物堿類和香豆素類化合物等，其中多糖是其重要的活性成分之一，具有調節(jié)機體免疫功能、抗生物分子氧化等活性。本課題前期的研究表明，牛膝多糖對四氯化碳所致化學性肝損傷有一定保護作用，本實驗進一步觀察了牛膝多糖對BCG(卡介苗)+LPS(脂多糖)聯(lián)合誘導小鼠產(chǎn)生免疫性肝損傷的影響。

1 材料和方法

1.1 藥品與試劑

牛膝由泰山醫(yī)學院藥學院購進，經(jīng)本院生藥學教研室鑒定為懷牛膝；聯(lián)苯雙酯滴丸，德州德藥制藥公司，批號061005 ；無水乙醇，分析純，天津市廣成化學試劑有限公司，批號為080215；0.9%氯化鈉注射液(normal NS)，山東省泰安制藥廠，批號07033102；GPT、SOD、MDA試劑盒，南京建成生物工程研究所；卡介苗，上海生物制品研究所；脂多糖，Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 儀器

BT-815A自動生化測試分析系統(tǒng)，上海三科儀器有限公司；電子分析天平AR2140，奧豪斯(上海)公司；LXJ-IIB型低速大容量離心機，上海安亨科學儀器廠。

1.3 動物

昆明種小鼠，18～22 g，雌雄兼用，由泰山醫(yī)學院動物實驗中心提供。

1.4 方法

1.4.1牛膝多糖的提取純化和含量測定[2]取粉碎至適當顆粒的牛膝藥材40 g，置1000 ml容量瓶中加80%乙醇200 ml浸泡14 h，微沸回流脫脂2次，每次2 h。殘渣濾干置1000 ml圓底燒瓶中按料液比1︰15加水600 ml，80℃，提取兩次，每次3 h。合并兩次提取的濾液，置旋轉蒸發(fā)儀上濃縮至約100 ml。Savage試劑法脫蛋白，加入3倍的Savage試劑充分震蕩混勻，5000 r/min離心15 min，取上清液重復脫蛋白操作2次，至不再出現(xiàn)蛋白。將所得溶液按1︰5加入無水乙醇進行醇沉，靜置一夜，5000 r/min離心15 min，所得粉末用CCl4洗滌2次，乙醚洗滌2次，每次洗滌后離心。干燥的白色粉末即為牛膝多糖，用苯酚—硫酸法測定所提取牛膝多糖含量為74.28%。

1.4.2動物分組與給藥 取小鼠60只，雌雄各半，按性別和體重隨機分為5組。①生理鹽水對照組；②模型對照組；③聯(lián)苯雙酯150 mg·kg-1·d-1陽性對照組；④⑤分別為牛膝多糖150 mg·kg-1·d-1、300 mg·kg-1·d-1實驗組。③組灌胃聯(lián)苯雙酯150 mg·kg-1·d-1，④⑤組分別灌胃牛膝多糖150 mg·kg-1·d-1、300 mg·kg-1·d-1，①②組分別灌胃等容量生理鹽水，連續(xù)給藥10天。參照文獻[3]，制作小鼠免疫性肝損傷模型，即由尾靜脈注射0．2 ml內(nèi)含2.0 mg BCG的生理鹽水溶液，10 d后每鼠尾靜脈注射7.5 μg LPS。12 h后小鼠摘眼球取血，4000 r/min離心15 min分離血清，測定血清中ALT的含量。上述取血后處死小鼠剖取出肝臟、胸腺、脾臟。肝臟置生理鹽水中洗凈血液，拭干稱取0.5 g用冷生理鹽水制成10%肝勻漿，3500 r/min離心10 min，取上清測定ALT、 MDA、SOD的含量。胸腺、脾臟稱其質量，計算臟器指數(shù)[臟器指數(shù)=臟器重(mg)/體重(g)]。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 牛膝多糖對免疫性肝損傷小鼠血清和肝組織中ALT的影響

由表1可見，與正常對照組比較，模型組小鼠血清和肝組織ALT顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明造模成功。與模型組相比，牛膝多糖低劑量組與聯(lián)苯雙酯組小鼠血清和肝組織ALT均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 牛膝多糖對免疫性肝損傷小鼠血清和肝組織中ALT的影響

注：與NS對照組比較：#P<0.05；與模型對照組比較：*P<0.05。

2.2 牛膝多糖對免疫性肝損傷小鼠肝組織MDA、SOD的影響

由表2可見，與正常對照組比較，模型組小鼠肝組織MDA水平明顯升高， SOD水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組相比，低劑量牛膝多糖與聯(lián)苯雙酯能明顯降低肝勻漿MDA的含量，提高SOD的水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 牛膝多糖對免疫性肝損傷小鼠肝組織MDA、SOD的影響

注：與NS對照組比較：#P<0.05；與模型對照組比較：*P<0.05。

2.3 牛膝多糖對免疫性肝損傷小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)的影響

由表3可見，與正常對照組比較，模型組小鼠脾臟、胸腺指數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，P<0.05)，表明BCG+LPS損傷后導致脾臟、胸腺增大。與模型組相比，低劑量牛膝多糖與聯(lián)苯雙酯能降低增大的脾臟、胸腺的質量指數(shù)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表3 牛膝多糖對免疫性肝損傷小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)的影響

注：與NS對照組比較：##P<0.01，#P<0.05；與模型組比較：*P<0.05。

3 討 論

目前，多數(shù)學者認為乙型肝炎病毒感染引起的肝損傷主要與機體免疫應答有關[4-5]，采用BCG+LPS誘導的免疫性肝損傷病理改變與肝細胞損傷機制均與乙型病毒性肝炎相類似。以BCG+LPS聯(lián)合誘導小鼠制造免疫性肝損傷小鼠模型，較以往用化學物質造成的肝損傷模型在病理生理機制上更接近人體肝炎。給小鼠注射卡介苗可使巨噬細胞和中性多核粒細胞聚集于肝臟,使肝臟處于致敏狀態(tài)，繼而用低毒劑量的脂多糖攻擊,可激發(fā)這些細胞釋放TNFα等炎癥因子,造成肝臟炎癥、壞死[6]。

本實驗模型組小鼠血清和肝組織ALT顯著升高，肝細胞受到明顯損傷，脾臟、胸腺質量指數(shù)增大，說明模型建立成功。低劑量牛膝多糖與聯(lián)苯雙酯均能降低肝損傷小鼠血清和肝勻漿中轉氨酶的水平，降低增大的脾臟、胸腺的質量指數(shù)，提示牛膝多糖可明顯減輕肝細胞損傷。MDA和SOD是反映脂質過氧化損傷的指標，可間接反應細胞內(nèi)脂質過氧化損傷的程度。本實驗結果發(fā)現(xiàn)，牛膝多糖低劑量可降低肝勻漿MDA的含量，使降低的SOD活性升高，表明牛膝多糖有一定的肝細胞膜結構和功能穩(wěn)定作用，這可能與其清除自由基等抗氧化作用密切相關。實驗發(fā)現(xiàn)，牛膝多糖高劑量表現(xiàn)一定的保肝、抗氧化的趨勢，但多數(shù)缺乏統(tǒng)計學意義，具體原因尚需進一步研究。

以上研究提示，牛膝多糖可保護BCG+LPS聯(lián)合誘導的免疫性肝損傷，其抗氧化作用可能是其保肝降酶作用的重要機制之一。

[1] 國家藥典委員會．中華人民共和國藥典[S]．北京：化學工業(yè)出版社，2005：49，26．

[2] 汪茂田，謝培山，王忠東，等．天然有機化合物提取分離與結構鑒定[M]．北京：化學工業(yè)出版社，2004：8．

[3] Nagai H,Yakuo I,Yamada H,et a1. Liver injury model in mice for immunopharmacological study [J]. Japan J Pharmacol, 1988, 46(3): 247-254．

[4] 王華，魏偉，岳莉，等．白芍總苷對卡介苗加脂多糖引起的小鼠免疫性肝損傷的保護作用[J]．中國藥理學通報，2004，20(8)：875-879．

[5] 熊筱娟，肖小華，徐麗英，等．烏索酸對小鼠急性免疫性肝損傷的影響[J]．中成藥，2005，27(11)：1352-1354．

[6] 商玉萍，方士英，葛金芳，等．蟲草多糖對小鼠免疫性肝損傷的保護作用[J]．華西藥學雜志，2007，22(6)：654-655．