鄭鴻燕 邰浩清 曾水林

哺乳動物出生后毛細胞不具有再生能力[1]，所以毛細胞的任何損傷都可導(dǎo)致永久性感音神經(jīng)性聽力減退和平衡功能障礙。胚胎干細胞具有自我更新特性和多分化潛能，研究表明采用干細胞移植治療感音神經(jīng)性聾能夠緩解聽力減退，但是內(nèi)耳干細胞存活數(shù)量較少, 不到10%[2], 如何提高植入干細胞的存活率是目前迫切需要解決的問題，移植后其確切的凋亡時相變化特點也需進一步闡明。當歸補血湯具有清除氧自由基和抗脂質(zhì)過氧化作用,它在抗細胞凋亡方面的作用非常值得探討[3]。本研究采用感音神經(jīng)性聾大鼠模型，對耳蝸干細胞移植后其干細胞凋亡的時程、細胞形態(tài)學(xué)特點及當歸補血湯的抗凋亡作用進行研究，報告如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物及試劑、儀器 SD大鼠由南京中醫(yī)藥大學(xué)動物室提供。Neurobasal培養(yǎng)基、B27 輔助培養(yǎng)基(GIBCO公司)；堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、胎牛血清(FCS)(杭州四季青生物工程材料研究所)；多聚賴氨酸、胰蛋白酶、Nestin抗體、Brdu 以及其單克隆抗體、Myosin ⅦA抗體(Sigma公司)。

主要儀器有離心機、超凈工作臺、二氧化碳培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡。

1.2耳蝸干細胞取材、培養(yǎng)和鑒定方法 麻醉1只孕E14SD大鼠，取出胚胎(共8只)，在超凈工作臺上分離出耳蝸，分離Corti器，HBSS 液沖洗幾次后剪碎，加入0.125%胰蛋白酶37℃消化30 min，中止反應(yīng)之后加入0.01 %DNA酶，吸管輕柔吹打成單細胞懸液。以1×105/ml的細胞密度移入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，每隔3 d半量置換培養(yǎng)基。培養(yǎng)7～9 d后，機械分離細胞球進行傳代培養(yǎng)，然后行Nestin和Brdu免疫熒光染色鑒定[4]。

1.3當歸補血湯含藥血清制作 當歸補血湯(金元時代李東垣創(chuàng)造的益氣補血湯劑)中只有黃芪和當歸兩味藥，根據(jù)“陽生陰長”的理論配伍(黃芪∶當歸=5∶1)，臨床等效藥物濃度為0.5 g/ml。大鼠在第1～3天早晚各給藥2 ml/100 g，第4天1次服用全天劑量，采血前禁食12 h，末次給藥2 h后采血。取血后分離血清，56℃滅活30 min，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4感音神經(jīng)性聾大鼠模型建立 選擇聽力正常健康大鼠125只，體重180～200 g，雌雄兼用，耳廓反射靈敏，無強噪聲暴露及耳毒性藥物使用史， 活殺時未發(fā)現(xiàn)中耳炎。50 mg/kg硫酸慶大霉素腹腔注射，早晚各1 次， 每日檢測ABR(EP2566聽覺腦干誘發(fā)電位儀)1次，以波IV剛出現(xiàn)的刺激強度為閾值，以閾值上升30 dB為停藥指標。

1.5耳蝸干細胞移植 感音神經(jīng)性聾大鼠隨機分為耳蝸干細胞移植組(45只)、當歸補血湯干預(yù)組(45只)及對照組(35只)。分別將耳蝸干細胞懸液、含有當歸補血湯的耳蝸干細胞懸液和生理鹽水移植入大鼠耳蝸鼓階。方法：將感音神經(jīng)性聾大鼠固定在手術(shù)臺上，水合氯醛深度麻醉，在一側(cè)外耳上部做1.5 cm的手術(shù)切口，用鉆頭鉆開直徑為1 cm的小洞，發(fā)現(xiàn)中耳鼓室后，尋找耳蝸螺旋，用微型鉆頭在耳蝸鼓階鉆洞。用微量加樣器吸入移植液，植入耳蝸鼓階，每點共注射單細胞懸液9 μl，分三段注射，每段3 μl，注射速度為1 μl /min；注射完畢后，留針5 min；全部注射完畢留針10 min后縫合。

1.6耳蝸取材 三組動物分別在移植后1、3、5、10、15天各隨機抽取7只大鼠，戊巴比妥鈉深度麻醉后，經(jīng)左心室插管至主動脈，快速灌注生理鹽水150 ml，后用4%多聚甲醛灌注固定，取移植側(cè)耳蝸，后固定24小時用于石蠟切片。另外，耳蝸干細胞移植組、當歸補血湯干預(yù)組每組分別于上述時間點再各隨機抽取2只大鼠，戊巴比妥鈉深度麻醉后，取新鮮耳蝸組織標本用于流式細胞儀檢測。

1.7免疫熒光染色 Nestin免疫熒光染色鑒定耳蝸干細胞。確定是耳蝸干細胞后進行Brdu(檢測具有增殖特性的耳蝸干細胞的細胞核)、Caspase-3(檢測凋亡的移植內(nèi)耳干細胞)和Bcl-2抗體(檢測抗細胞凋亡基因蛋白)免疫熒光染色。Nestin多克隆抗體(1:1 000小鼠抗大鼠)、Myosin ⅦA(1:500小鼠抗大鼠)、Caspase-3(1:1 000小鼠抗大鼠)4℃ 24 h, 用0.01 mol/L PBS漂洗三次，Nestin、Myosin ⅦA加山羊抗兔FITC(1：100)(陽性判斷標準為綠色熒光)， Brdu、Caspase-3加山羊抗小鼠羅丹明(1：200)(陽性判斷標準為紅色熒光)， 37℃ 2h，用0.01 mol/L PBS漂洗三次，倒置相差熒光顯微鏡下觀察并攝片，測量細胞累積吸光度(IA)。

1.8流式細胞儀檢測 檢測移植組和干預(yù)組大鼠耳蝸干細胞移植后其干細胞凋亡率，各組分別分析10 000個細胞，采用Annexin V和PI雙標方法，在雙量變流式細胞儀的散點圖上Annexin V+PI-代表早期凋亡細胞，Annexin V-PI+代表壞死細胞。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 熒光顯微鏡下細胞累積吸光度(IA)比較采用Independent - samples-one - way進行檢驗。對所有數(shù)據(jù)進行方差分析。

2 結(jié)果

2.1孕E14SD大鼠耳蝸干細胞的培養(yǎng)和鑒定 孕E14SD大鼠耳蝸取材的干細胞，培養(yǎng)5～6天后可見大量的懸浮的細胞團形成，呈桑葚狀，這些細胞球經(jīng)Nestin免疫熒光鑒定呈陽性反應(yīng)，表明是具有自我更新能力的干細胞(圖1、2)。傳代培養(yǎng)5 d后的典型細胞克隆球幾乎呈Brdu/Nestin免疫熒光雙標，說明所培養(yǎng)的細胞具有增殖能力，且屬于神經(jīng)前體細胞。在傳代培養(yǎng)瓶中偶可見到傳代時未被打散的細胞克隆球增殖為巨大克隆球(圖3)。

2.2感音神經(jīng)聾大鼠模型內(nèi)耳毛細胞檢測 排列欠整齊(圖4)。

2.3Nestin免疫熒光檢測結(jié)果 移植后1、3、5、10、15天，耳蝸干細胞移植組和當歸補血湯干預(yù)組移植部位(鼓階)有大量Nestin免疫熒光陽性細胞(圖5)，正常對照組無免疫熒光陽性細胞。三組移植后不同時間細胞累積吸光度(IA值)比較見表1。

2.4Caspase-3檢測結(jié)果 移植后1、3、5、10、15天，耳蝸干細胞移植組、當歸補血湯干預(yù)組大鼠鼓階有大量Caspase-3免疫熒光陽性細胞，對照組無免疫熒光陽性細胞。三組大鼠細胞累積吸光度(IA值)比較見表2。當歸補血湯干預(yù)組的凋亡細胞數(shù)量較耳蝸干細胞移植組少(圖6)，對照組整張片子呈較弱的熒光反應(yīng)。

2.5BCL-2檢測結(jié)果 移植后1、3、5、10、15天，耳蝸干細胞移植組、當歸補血湯干預(yù)組鼓階部位有大量BCL-2免疫熒光陽性細胞，對照組無免疫熒光陽性細胞。三組細胞累積吸光度(IA值)比較見表3。當歸補血湯干預(yù)組的BCL-2免疫熒光陽性細胞數(shù)量較耳蝸干細胞移植組多(圖7)，對照組整張片子呈較弱的熒光反應(yīng)。

2.6流式細胞儀檢測結(jié)果 耳蝸干細胞移植組和當歸補血湯干預(yù)組耳蝸干細胞凋亡率均在移植后3～5天達到峰值，然后進入平臺期；當歸補血湯干預(yù)組在移植后各個時間點的干細胞凋亡率均低于耳蝸干細胞移植組(表4)。

圖1體外培養(yǎng)的單個細胞(形成細胞球前)(倒置顯微鏡×200)

圖2體外培養(yǎng)的Nestin免疫熒光陽性細胞球(熒光顯微鏡×200)

圖3體外培養(yǎng)的Brdu/Nestin陽性的細胞(熒光顯微鏡×200)

圖4感音神經(jīng)性聾模型大鼠耳蝸切片(熒光顯微鏡×200)圖5移植的Nestin+的耳蝸干細胞(熒光顯微鏡×200)

圖6 Caspase-3免疫熒光陽性細胞(熒光顯微鏡×200)

圖7 BCL-2免疫熒光陽性細胞(熒光顯微鏡×200)

表1 三組大鼠移植后不同時間Nestin陽性細胞IA值(n=7耳)

注：*與當歸補血湯干預(yù)組比較，P<0.01

表2 三組大鼠移植后不同時間Caspase-3細胞IA值(n=7耳)

注：*與當歸補血湯干預(yù)組比較，P<0.01

表3 三組大鼠移植后不同時間Bcl-2細胞IA值(n=7耳)

注：*與當歸補血湯干預(yù)組比較，P<0.01

表4 兩組大鼠移植后不同時間耳蝸干細胞凋亡率 (%)

注：*與當歸補血湯干預(yù)組比較，P<0.05

3 討論

干細胞具有自我更新能力, 可以在體外大量增殖, 提供充足的細胞來源。目前，神經(jīng)干細胞已用于腦移植、脊髓移植等來治療帕金森病、脊髓損傷等病變[5～7]，研究者們也嘗試用干細胞移植治療耳聾。

2003年，Li等從成年小鼠內(nèi)耳橢圓囊分離培養(yǎng)了出干細胞[8]；Ito等[9]將神經(jīng)干細胞移植入耳蝸2周后, 發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細胞位于蝸管的內(nèi)壁, 4周時神經(jīng)干細胞遷移至Corti器毛細胞的表面并具有內(nèi)毛細胞或外毛細胞的形態(tài)。上述研究表明干細胞可以進入毛細胞缺失的感覺上皮內(nèi), 并可以分化為內(nèi)耳毛細胞。但實驗中耳蝸干細胞移植后聽功能的改善遠遠未能達到預(yù)期目標，其中一個重要原因在于干細胞移植后存活率很低，其主要原因是發(fā)生了細胞壞死和凋亡[10]。所以，如何提高移植的干細胞存活率是目前迫切需要解決的問題。

研究已證實當歸補血湯含有阿魏酸、多種磷脂、人體必需氨基酸和微量元素等[11～13]。阿魏酸是當歸抗氧化作用的有效成分，具有清除氧自由基和抗脂質(zhì)過氧化作用,對神經(jīng)生長起著營養(yǎng)維持的作用，以往實驗表明當歸補血湯能夠促進細胞增殖，誘導(dǎo)分化[14]。本課題組前期離體實驗研究發(fā)現(xiàn)當歸補血湯能促進Brdu和Nestin雙標陽性的干細胞數(shù)量增多，推測與減少細胞凋亡有關(guān)[4，15]。本實驗結(jié)果顯示：耳蝸干細胞移植入內(nèi)耳后1～3天細胞壞死率較高，推測可能與移植時組織內(nèi)大量缺血缺氧和麻醉有關(guān)；而耳蝸干細胞移植入內(nèi)耳后3～5天，細胞凋亡率遠遠大于細胞壞死率，此后下降進入平臺期，因此可以推斷干細胞移植入內(nèi)耳后3～5天死亡的主要方式為細胞凋亡，提示抗凋亡干預(yù)應(yīng)在移植后的3～5天開始。

本實驗采用免疫熒光染色方法發(fā)現(xiàn)耳蝸干細胞移植組和當歸補血湯干預(yù)組大鼠耳蝸切片移植針道周圍可見大量的Nestin免疫熒光陽性細胞，說明移植的是內(nèi)耳干細胞，其中當歸補血湯干預(yù)組的Nestin陽性細胞IA值高于耳蝸干細胞移植組。而且當歸補血湯干預(yù)組的Caspase-3陽性細胞IA值低于耳蝸干細胞移植組，說明當歸補血湯對移植的內(nèi)耳干細胞具有保護作用，能夠阻斷干細胞凋亡的連鎖反應(yīng)，減少移植的內(nèi)耳干細胞凋亡。因此，應(yīng)用當歸補血湯來增加移植的干細胞的存活率也許能達到預(yù)期的效果。Bcl-2 是重要的抗細胞凋亡基因,器官受損時可通過其自身過度表達,抑制Ca2 +釋放,阻止促細胞凋亡基因信號傳遞,發(fā)揮抗細胞凋亡作用,從而減輕細胞損傷。本實驗結(jié)果同時顯示當歸補血湯干預(yù)組的Bcl-2陽性細胞IA值明顯高于耳蝸干細胞移植組，由此推斷當歸補血湯的抗凋亡機制可能通過促進 Bcl-2 蛋白表達增加來抑制細胞凋亡的發(fā)生。另外推測當歸補血湯還可能通過改善缺血微環(huán)境,促進移植組織分泌細胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)營養(yǎng)因子等物質(zhì)抑制遲發(fā)性干細胞凋亡,從而減少移植的內(nèi)耳干細胞凋亡。其具體機制有待進一步研究。

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