喬振花 戴艷紅 徐琳 佘萬東

分泌性中耳炎(otitis media with effusion,OME)最常見病因?yàn)檠使墓茏枞蚬δ懿涣肌鴥?nèi)外有數(shù)種方法創(chuàng)建OME模型用于研究該疾病，但國內(nèi)創(chuàng)建模型的方法多為經(jīng)鼓膜直接注射致病因子，誘發(fā)感染及變態(tài)反應(yīng)導(dǎo)致中耳積液的產(chǎn)生[1]，也有經(jīng)手術(shù)切斷顎帆張肌和翼突鉤，或切斷支配它的三叉神經(jīng)分支等破壞咽鼓管的功能以誘發(fā)中耳積液產(chǎn)生的方法[2]。本研究擬經(jīng)頜下徑路阻塞咽鼓管骨性部分以非化學(xué)方法建立OME動(dòng)物模型，旨在為研究OME可能導(dǎo)致的內(nèi)耳損傷提供無化學(xué)因素干擾的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物選擇及模型建立[3]選擇清潔級(jí)雄性SD大鼠24只，2月齡，體重180～220 g,南京大學(xué)附屬鼓樓醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有動(dòng)物耳廓反射靈敏，耳鏡檢查外耳道清潔，鼓膜標(biāo)志清晰，ABR和聲導(dǎo)抗檢測(cè)正常。右耳為實(shí)驗(yàn)組(n=24)，左耳為空白對(duì)照組(n=24)。取每只大鼠右側(cè)耳手術(shù)造模，2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉,將麻醉好的動(dòng)物仰臥位安置于手術(shù)臺(tái)上，剃去頸部的毛發(fā)，皮膚用1%聚維酮碘溶液消毒。在下頜弓下0.5 cm處作一與下頜弓平行、1.5～2.0 cm長(zhǎng)的橫形切口，鈍性分離皮下組織，暴露右側(cè)聽泡腹側(cè)面。確認(rèn)咽鼓管的骨性部分后，在其上鉆孔，并用消毒過的直徑1～2 mm的木塞阻塞該孔(圖1)，術(shù)后用75%酒精溶液消毒切口并縫合，在電烤燈下保溫直至動(dòng)物完全從麻醉中清醒,隨后送至籠中飼養(yǎng)。術(shù)后常規(guī)肌肉注射青霉素5天(20萬U·kg-1·d-1)。于術(shù)后14、21、30、60 d分別行雙側(cè)ABR及聲導(dǎo)抗檢測(cè),以ABR閾值升高、出現(xiàn)“B”型鼓室導(dǎo)抗圖作為OME造模成功的客觀依據(jù)，在耳內(nèi)鏡下觀察鼓膜，并排除術(shù)后乳突炎和化膿性中耳炎的動(dòng)物。

1.2ABR檢測(cè) 測(cè)試在隔聲屏蔽室進(jìn)行。2%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射，采用頭皮針形電極，記錄電極置于顱頂中線，參考電極置給聲側(cè)耳后，零極置鼻根部。短聲刺激，經(jīng)耳機(jī)給聲，刺激頻率為13.1次/秒，帶通濾波150～1 500 Hz，疊加次數(shù)為1 024次，記錄時(shí)程10 ms。記錄ABR反應(yīng)閾及90 dB SPL聲刺激時(shí)ABR波I、III潛伏期及Ⅰ-Ⅲ波間期。以波Ⅲ作為判斷反應(yīng)閾的依據(jù)。

1.3聲導(dǎo)抗測(cè)試 以2%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，待充分麻醉后，清除外耳道耵聹。應(yīng)用與郭志強(qiáng)等[4]相似的方法即：應(yīng)用GSI-33VersionⅡ型中耳分析儀做鼓室導(dǎo)抗圖測(cè)試，將內(nèi)徑約2 mm自制橡膠探頭套于與之匹配的嬰兒探頭之外，使之可與大鼠外耳道完全密封。將大鼠頭部用自制頭架固定，探測(cè)音為226 Hz、85 dB SPL,壓力變化范圍從+200 daPa～-400 daPa,壓力變化速度400 daPa/s, 圖上直接讀出聲導(dǎo)納值(ml)、峰值(daPa)、耳道容積值(ml)及梯度值(daPa)。圖型按Linen/Jerger分類法[5]分類。

1.4中耳粘膜標(biāo)本制作 將測(cè)得B型曲線后的動(dòng)物麻醉后固定，心內(nèi)灌注4℃4%多聚甲醛,斷頭，取雙側(cè)聽泡，聽泡用4℃4%多聚甲醛灌注，石蠟包埋、切片機(jī)切片,常規(guī)脫蠟后行HE染色,光鏡下觀察。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SSPS11.0軟件進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1兩組大鼠聲刺激強(qiáng)度為90 dB時(shí)ABR波Ⅰ、Ⅲ潛伏期及反應(yīng)閾見表1。

2.2鼓室導(dǎo)抗圖測(cè)試結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組ABR反應(yīng)閾高于對(duì)照組(P<0.05)，波I、III潛伏期較對(duì)照組長(zhǎng)(P<0.05)，I-III波間期兩組無顯著差異。對(duì)照組大鼠麻醉狀態(tài)下均為A型或As型圖(本文統(tǒng)稱為有峰型)，對(duì)照組大鼠聲導(dǎo)納值、峰壓值、耳道容積及梯度值分別為0.57±0.09 ml、-21.00±24.24 daPa、0.42±0.07 ml和273.71±31.19 daPa，峰壓值在-50～+50之間的占95%(表2)。實(shí)驗(yàn)組24耳中20耳鼓室導(dǎo)抗圖為平坦型(B型圖)(16耳于14 d時(shí)測(cè)得，3耳于21 d時(shí)測(cè)得，1耳于30 d時(shí)測(cè)得)，2耳60 d時(shí)仍為有峰型圖，判為造模不成功，1耳為化膿性中耳炎，1耳為化膿性乳突炎，無動(dòng)物死亡，造模成功率為83.3%(20/24)。

表1 兩組大鼠ABR反應(yīng)閾(dB SPL)及90 dB SPL聲刺激時(shí)波Ⅰ、Ⅲ潛伏期、Ⅰ-Ⅲ波間期(ms)比較

注：*與對(duì)照組比較，P<0.05

表2 正常大鼠鼓室峰壓值分布范圍

2.3光鏡下見對(duì)照組咽鼓管黏膜細(xì)胞核排列整齊，皮下為致密纖維結(jié)締組織，血管甚少，緊貼于軟骨表面，無炎性細(xì)胞(圖2)；而實(shí)驗(yàn)組咽鼓管黏膜上皮層次增多，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，黏膜下毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，明顯增生(圖3)。對(duì)照組中耳黏膜下層有少許纖維母細(xì)胞和少許膠原纖維以及中性多形核白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，纖毛排列整齊(圖4)；實(shí)驗(yàn)組中耳腔黏膜出現(xiàn)成纖維細(xì)胞增生，新生血管增多，單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，中耳黏膜明顯增厚，纖毛倒伏、缺失(圖5、6)。

3 討論

OME發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，普遍認(rèn)為可能與咽鼓管通氣功能不良、細(xì)菌病毒感染及免疫功能紊亂相關(guān)[6]。目前構(gòu)建OME動(dòng)物模型的方法有：①經(jīng)鼓膜直接注射卵蛋白、肺炎鏈球菌血清、有莢膜或無莢膜細(xì)菌、死菌或脂多糖等，通過誘發(fā)感染及變態(tài)反應(yīng)途徑導(dǎo)致中耳腔產(chǎn)生積液，但此法可造成鼓膜完整性的破壞，易引起術(shù)后注射部位愈合不良、局部反應(yīng)較重、中耳腔感染播散等，而導(dǎo)致造模成功率下降[1]。②破壞咽鼓管的通氣功能。常用兩種方法：一是阻塞咽鼓管咽口，如用化學(xué)制劑或電灼致咽鼓管口疤痕粘連而阻塞，或者用彈性材料封堵咽鼓管咽口；二是破壞咽鼓管的開放功能，如手術(shù)切斷顎帆

圖1 手術(shù)圖示 圖2 對(duì)照組咽鼓管黏膜(HE×400) 圖3 模型組咽鼓管黏膜(HE×400)

圖4 對(duì)照組中耳腔黏膜(HE×400) 圖5 模型組中耳腔黏膜(HE×400) 圖6 模型組中耳腔黏膜(HE×400)

張肌和翼突鉤，或切斷支配它的三叉神經(jīng)分支等。該方法手術(shù)創(chuàng)傷較大，操作困難，動(dòng)物會(huì)因術(shù)中、術(shù)后窒息或因疼痛影響動(dòng)物進(jìn)食、術(shù)后急性肺水腫等死亡，故死亡率較高[7]。但若造模成功，中耳腔積液的產(chǎn)生率很高(80%)[2]。經(jīng)腭徑路和經(jīng)下頜徑路都是通過阻塞咽鼓管導(dǎo)致中耳積液而形成分泌性中耳炎，可以避免因化學(xué)及生物學(xué)因素導(dǎo)致的損傷。經(jīng)頜下徑路雖因打開了聽泡有導(dǎo)致化膿性中耳炎的可能，但手術(shù)過程中如注意無菌操作，術(shù)后常規(guī)應(yīng)用抗生素預(yù)防感染，可以降低化膿性中耳炎的發(fā)生率。且經(jīng)頜下徑路可避免術(shù)后疼痛影響動(dòng)物進(jìn)食、術(shù)中誤吸血液而導(dǎo)致窒息的可能。本組24只大鼠(24耳)，采用頜下徑路阻塞咽鼓管的方法建立OME模型，動(dòng)物無術(shù)中死亡，術(shù)后至少可以存活60 d。

本文結(jié)果可見，正常大鼠鼓室導(dǎo)抗圖的峰壓值為-21±24.24 daPa，在-50～+50之間的占95%，表明其咽鼓管功能良好。而實(shí)驗(yàn)組20耳鼓室導(dǎo)抗圖為B型，說明木塞阻塞咽鼓管后，咽鼓管功能發(fā)生障礙，導(dǎo)致了中耳腔負(fù)壓，最終導(dǎo)致中耳積液的產(chǎn)生。從兩組的ABR反應(yīng)閾來看，實(shí)驗(yàn)組手術(shù)后ABR反應(yīng)閾明顯提高，波Ⅰ、Ⅲ潛伏期顯著延長(zhǎng)，Ⅰ-Ⅲ波間期無明顯變化，說明其聽力下降主要為傳導(dǎo)性聾，即鼓室積液導(dǎo)致鼓膜及圓窗膜振動(dòng)受限所致[8]。說明OME模型成功建立。

從中耳粘膜的光鏡下所見看，實(shí)驗(yàn)組大鼠咽鼓管上皮層次增多，小血管明顯充血，鼓室黏膜上皮細(xì)胞明顯增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，黏膜下毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，明顯增生；術(shù)后四周出現(xiàn)成纖維細(xì)胞增生，新生血管增多，單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，中耳黏膜明顯增厚，因此，組織學(xué)上也證實(shí)OME動(dòng)物模型造成模成功。造模成功率為83.3%。

綜上所述，通過頜下徑路阻塞咽鼓管的方法可以影響咽鼓管的功能，從而能成功建立OME動(dòng)物模型。

(致謝 ：本文在實(shí)驗(yàn)期間得到了上海交通大學(xué)耳鼻咽喉科學(xué)研究所殷善開教授、王堅(jiān)教授、黃艷艷老師的熱心指導(dǎo)，在此表示感謝！)

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