朱一鳴 郭玉芬 劉曉雯 王艷莉 徐百成 紀(jì)育斌 歷建強(qiáng) 李倩 王秋菊

目前的研究認(rèn)為，GJB2、SLC26A4基因和線粒體DNA12S rRNA m.1555A>G突變是導(dǎo)致非綜合征型耳聾(non-syndromic sensorineural hearing loss, NSHL)的常見分子病因，并且在不同種族、不同地域的耳聾人群中有不同的突變熱點(diǎn)和發(fā)病率[1]，該三個基因已作為臨床耳聾基因的常規(guī)檢查。國內(nèi)學(xué)者也在不同地區(qū)不同人群中進(jìn)行了上述基因的流行病學(xué)研究[2～5]。有學(xué)者曾對陜西省部分聾啞學(xué)生進(jìn)行了GJB2、SLC26A4基因及線粒體DNA12S rRNA m.1555A>G突變調(diào)查，三個基因的檢測陽性率分別是19.23%(10/52)、19.64%(11/56，為c.919-2G>A雜合和純合率)和1.72%(1/58)[3～5]，但樣本量偏小(分別為52、56、58例)。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)抽樣調(diào)查總體率樣本量(N)估計(jì)公式N=4×P(1-P)/δ2，以上三個基因的發(fā)病率作為P值(估計(jì)值)，δ(精度)分別設(shè)為5%、5%和2%，第一類錯誤概率α為0.05，進(jìn)行了最小樣本量預(yù)測，分別為249人(GJB2)，252人(SLC26A4)，169人(mtDNA12S rRNA m.1555A>G)，在以上允許的誤差范圍內(nèi)[6]。因此，本研究把樣本量擴(kuò)大到283人，對陜西省部分非綜合征聾啞學(xué)生進(jìn)行上述三個基因的聯(lián)合篩查，以了解該地區(qū)聾啞人群常見致聾基因的熱點(diǎn)突變及突變頻率，為耳聾的防治提供分子病因依據(jù)。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取陜西省四個特殊教育學(xué)校：漢中市特殊教育學(xué)校、咸陽市特殊教育學(xué)校、榆林市特殊教育學(xué)校以及神木縣特殊教育學(xué)校的283名來自于不同家庭的非綜合征型耳聾學(xué)生，漢族，其中男165人，女118人，男女比例為1.40:1；年齡2～27歲，平均12.23±4.79歲。

1.2方法

1.2.1病史采集 采用問卷調(diào)查及當(dāng)場詢問(家長或是老師)為主，電話家訪為輔，內(nèi)容主要包括：外耳和中耳疾病史、母孕期智力檢查，有無異常和出生時是否缺氧、是否早產(chǎn)、耳聾前后有無明確頭部外傷史、家族史、耳毒性藥物的使用情況等，繪制相應(yīng)的家系圖譜，建立詳盡的病歷檔案[7]。

1.2.2檢查與采血 ①體檢：全部對象均進(jìn)行全身(智力、生長發(fā)育、是否合并其他系統(tǒng)疾病等)和?？茩z查(外耳內(nèi)耳發(fā)育)以排除綜合征型耳聾；②聽力學(xué)檢查：主要運(yùn)用Madsen502便攜式聽力計(jì)進(jìn)行純音測聽(PTA)或以美國智聽公司Smart EP 聽覺誘發(fā)電位儀檢測聲導(dǎo)抗和聽性腦干反應(yīng)(ABR)檢查；③在知情同意的情況下抽取患者外周靜脈血5～10 ml，ACD-EDTA抗凝，避免震蕩、溶血，4℃運(yùn)送至國家人類基因組北方研究中心保存。

1.2.3基因組DNA的制備與保存 用飽和氯化鈉抽提法[8](鹽析法)提取外周血白細(xì)胞DNA，TE溶解，1%瓊脂糖電泳定性、紫外分光光度計(jì)定量和純度檢測，配制好的工作液4℃保存?zhèn)溆?，原?80℃長期保存。

1.2.4PCR擴(kuò)增及酶切反應(yīng)[2]GJB2基因和SLC26A4基因的第8和第19外顯子的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向直接測序，擴(kuò)增767bp長度的mtDNA nt 1229～nt 1995目的片斷，以Alw26Ι內(nèi)切酶鑒定突變體，酶切陽性的樣品進(jìn)行直接測序。

1.2.5測序與生物學(xué)分析 所有測序均用雙脫氧鏈終止法在ABI Prism 3700測序儀上直接測序, 將測序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對, 確定基因突變位點(diǎn)。測序結(jié)果與均來自NCBI上的標(biāo)準(zhǔn)序列(GJB2: NG_008358.1；SLC26A4: NT_007933.15；mtDNA: NC_012920.1)在DNA Star 7.0和Sequencher 4.9上進(jìn)行對比分析。

2 結(jié)果

2.1線粒體DNA12S rRNA m.1555A>G檢測結(jié)果 283例患者共檢測到9例m.1555A>G均質(zhì)性突變，檢出率為3.18%(9/283)，所有攜帶m.1555A>G突變的患者同時發(fā)生了m.1438A>G位點(diǎn)的均質(zhì)性多態(tài)改變，其中1例患者同時攜帶m.1555A>G均質(zhì)性突變、m.1438A>G和m.1715C>T均質(zhì)性多態(tài)改變。除9例均質(zhì)性突變者外，還有1例患者同時攜帶m.1555A>G和m.1819C>T異質(zhì)性堿基改變(圖1)。

圖1 mtDNA12S rRNA 兩個異質(zhì)性改變測序圖A：m.1555A>G異質(zhì)性突變，B：m.1819C>T異質(zhì)性改變

2.2GJB2基因突變檢測結(jié)果 283人中有55例患者明確為GJB2基因突變(包括純合、復(fù)合雜合以及已知的顯性突變)所致耳聾，占檢測人數(shù)的19.43%(55/283)(表1)；8例為突變攜帶者，另有133例檢測到GJB2基因的其他堿基序列改變。表2為GJB2基因主要突變的等位基因發(fā)生頻率和共檢測到的17種堿基改變，包括11種致病突變(含2種顯性致病：c.551G>A和c.224G>A)、4種多態(tài)、1種新突變(c.557C>T) 及1種存在爭議的突變(c.109G>A)。其中，c.235delC和c.299_300delAT等位基因頻率分別為14.13%(80/566)、3.89%(22/566)，占所有致病等位基因數(shù)的87.18%(102/117)，是該地區(qū)的熱點(diǎn)突變。

2.3SLC26A4基因突變檢測結(jié)果 通過外顯子8和19的檢測，7例(2.47%，7/283)患者為SLC26A4基因雙等位基因突變(純合和復(fù)合雜合突變)，均為c.919-2A>G和c.2168A>G(p.H723R)突變；13例攜帶有SLC26A4基因單等位基因堿基改變，其中，有三種其他突變c.919-18T>G、c.920C>T(p.T307M)和c.1001+32A>G(表3)。c.919-2A>G和c.2168A>G(p.H723R)占所有等位基因數(shù)的88.89%(24/27)(表4)。

表1 GJB2基因致病突變患者統(tǒng)計(jì)(例)

注：*已知的顯性突變(數(shù)據(jù)來源：http://davinci.crg.es/deafness/index.php)。本表不包括多態(tài)和可疑致病突變

表2 GJB2基因等位基因突變頻率統(tǒng)計(jì)

注：*占整個等位基因(283×2=566)的比例，不確定致病性和多態(tài)核苷改變不做統(tǒng)計(jì)

表3 SLC26A4基因堿基改變及人數(shù)(例)

表4 SLC26A4基因等位基因統(tǒng)計(jì)

3 討論

由于人種和地域的不同，GJB2、SLC26A4基因及mtDNA12S rRNA m.1555A>G突變在不同人種、不同國家的耳聾人群中的發(fā)病頻率及突變熱點(diǎn)都不同[1]。在國內(nèi)，由于樣本量的問題，如何得到三個基因在不同地區(qū)不同人群中的確切發(fā)病率一直是個值得關(guān)注的問題[6]，本研究在允許誤差分別為5%、5%和2%的情況下，應(yīng)用最小樣本量的采樣方法得到GJB2、SLC26A4基因及mtDNA12S rRNAm.1555A>G突變在陜西聾啞學(xué)生的發(fā)病率分別是19.43%(55/283)、2.47%(7/283)、3.18%(9/283)，GJB2突變率與既往報道類似；mtDNA12S rRNA m.1555A>G的突變率高于既往的報道，SLC26A4的突變率明顯低于既往國內(nèi)文獻(xiàn)的報道[既往報道單純c.919-2A>G的純合突變比率就達(dá)到10.7%(6/56)][4]，由此可見樣本量的偏差可導(dǎo)致突變比例明顯不同。

本研究中，GJB2基因的陽性檢測率與以往報道的該地區(qū)的陽性率基本接近[3]，c.235delC及c.299_300delAT為陜西地區(qū)GJB2基因主要突變形式也與以往報道吻合，可見，GJB2基因突變導(dǎo)致的先天性耳聾是該地區(qū)聾啞人群最主要的組成部分，所以對GJB2基因攜帶者進(jìn)行婚配指導(dǎo)是有效降低該地區(qū)耳聾人群的主要方法之一。Richard[9]和Hamelmann[10]曾對p.R75Q(c.224G>A)和p.R184Q(c.551G>A)突變致聾的常染色體顯性遺傳家系進(jìn)行過詳細(xì)報道。本研究也發(fā)現(xiàn)GJB2基因c.224G>A(p.R75Q)和c.551G>A(p.R184Q)突變分別與兩個常染色體顯性耳聾家系密切相關(guān)。

目前的研究顯示，在中國人群中SLC26A4第8、第19外顯子的c.919-2A>G和c. 2168A>G突變?yōu)闊狳c(diǎn)突變，尤其是c.919-2A>G[11]。因此，本研究針對上述兩個外顯子進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雙等位基因(純合和復(fù)合雜合)突變頻率為2.47%，與既往報道[4]不同，分析其原因，除樣本量差別外，由于SLC26A4基因突變是大前庭水管綜合征(large vestibul araqueduct syndrome，LVAS)的分子病因，LVAS是一種先天性內(nèi)耳畸形疾病，但患兒出生時聽力損失并不存在或尚未出現(xiàn)，多為出生后幾年發(fā)病，多數(shù)患兒已經(jīng)有了完整的語言體系，而且患者聽力下降為波動性，因此，患兒會佩戴助聽設(shè)施，很少在聾啞學(xué)校就讀，因此，這也是SLC26A4基因在聾啞學(xué)校學(xué)生中檢出率較低的可能原因。

有研究顯示，線粒體DNA12S rRNA m.1555A>G突變在中國西北地區(qū)(甘肅和青海)有較高的發(fā)病率[2, 12]，研究者認(rèn)為由于上述地區(qū)經(jīng)濟(jì)文化落后，抗生素濫用及近親結(jié)婚或少數(shù)民族局部區(qū)域內(nèi)通婚是導(dǎo)致該突變頻率較高的可能原因。本研究中，mtDNA12S rRNA m.1555A>G突變頻率為3.18%(9/283)，較甘肅、青海地區(qū)低，考慮可能原因?yàn)樵摰貐^(qū)主要為漢族，少數(shù)民族人口較少，局部區(qū)域或民族內(nèi)通婚較少。本研究同時還發(fā)現(xiàn)1例患者同時攜帶m.1555A>G和m.1819C>T異質(zhì)性改變，該患者的同胞姐姐亦為先天性聾患者，但mtDNA12S rRNA m.1555A>G檢查正常；m.1819C>T位于線粒體16S rRNA，該核酸改變是否致病、單獨(dú)致病或是聯(lián)合m.1555A>G同時致病，目前尚未確定[13，14]。

本研究進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了應(yīng)該盡可能按照流行病學(xué)的方法合理選擇樣本量，同時，可以明確陜西地區(qū)部分特教學(xué)校聾生25.08%(GJB2：19.43%，SLC26A4：2.47%， m.1555A>G：3.18%)的耳聾病因，有利于對該地區(qū)聾啞患者及其家系成員進(jìn)行有效的預(yù)防、治療及干預(yù)措施，并提供遺傳學(xué)指導(dǎo)。

(致謝：感謝蘭州易聽醫(yī)療設(shè)備有限公司和四所特教學(xué)校所有教職員工以及學(xué)生家長在本課題研究中給與的大力支持和幫助。)

4 參考文獻(xiàn)

1 Bayazit YA, Yilmaz M. An overview of hereditary hearing loss[J]. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec, 2006, 68: 57.

2 Guo YF, Liu XW, Guan J, et al. GJB2, SLC26A4 and mitochondrial DNA A1555G mutations in prelingual deafness in Northern Chinese subjects[J]. Acta Otolaryngologica, 2008, 128: 297.

3 Dai P, Yu F, Han B, et al. GJB2 mutation spectrum in 2063 Chinese patients with nonsyndromic hearing impairment[J]. Journal of Translational Medicine, 2009, 7: 26.

4 Dai P, Li Q, Huang DL, et al. SLC26A4 c.919-2A>G varies among Chinese ethnic groups as a cause of hearing loss[J]. Genetics in Medicine, 2008, 10: 586.

5 朱慶文, 劉新, 韓東一, 等. 西北五省573例非綜合征型耳聾患者線粒體DNA A1555G突變分析[J]. 臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志, 2007, 21: 460.

6 紀(jì)育斌, 韓東一, 王大勇, 等. 山東省聾啞學(xué)校485例耳聾患者易感基因突變檢測分析[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志, 2009, 86:2 531.

7 王秋菊, 楊偉炎, 韓東一.遺傳性耳聾資源的收集、保存及利用-綜合系統(tǒng)的建立[J]. 中華耳科學(xué)雜志, 2003, 1: 65.

8 Miller SA, Dykes DD,Polesky HF.A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells[J]. Nucleic Acids Research, 1988, 16: 1 215.

9 Richard G, White TW, Smith LE, et al. Functional defects of Cx26 resulting from a heterozygous missense mutation in a family with dominant deaf-mutism and palmoplantar keratoderma[J]. Human Genetics, 1998, 103: 393.

10 Hamelmann C, Amedofu GK, Albrecht K, et al. Pattern of connexin 26 (GJB2) mutations causing sensorineural hearing impairment in Ghana[J]. Human Mutation, 2001, 18: 84.

11 Wang QJ, Zhao YL, Rao SQ, et al. A distinct spectrum of SLC26A4 mutations in patients with enlarged vestibular aqueduct in China[J]. Clinical Genetics, 2007, 72: 245.

12 惠培林, 郭玉芬, 鮑曉林, 等. 青海省部分聾校學(xué)生線粒體DNA12SrRNAA1555G和GJB2基因突變篩查報告[J]. 聽力學(xué)及言語疾病雜志, 2009, 17: 23.

13 Khrapko K. Two ways to make an mtDNA bottleneck[J]. Nature Genetics, 2008, 40: 134.

14 Chinnery Pf, Howell N, Lightowlers RN, et al. MELAS and MERRF. The relationship between maternal mutation load and the frequency of clinically affected offspring[J].Brain, 1998, 121: 1 889.