鄭恩金,高大慶,洪 捷,陸承平

eha,遲緩愛德華菌一個毒力調(diào)控基因＊

鄭恩金1,高大慶1,洪 捷1,陸承平2

目的 探討遲緩愛德華菌(Edw ardsiella tarda,E.tarda)溶血相關(guān)基因(E.tarda haemolysin activator gene,eha)基因調(diào)控該菌毒力基因的作用。方法利用自殺質(zhì)粒p HM 5,缺失 E.tarda的eha基因,得到△eha缺失菌株,再構(gòu)建△eha株的互補菌株。通過平板溶血性法、接觸溶血法、上清溶血法,觀察野生株、△eha缺失株與及互補株溶血性的差異。利用M TT法比較三種細菌培養(yǎng)物的過濾液對Vero細胞的毒性的差別。利用H2O2抗性紙片擴散法,比較三種菌對過氧化氫抵抗力的差異。利用RT-PCR和SDD-PAGE電泳超速酸化離心法提取的鞭毛蛋白,比較三種細菌鞭毛基因的轉(zhuǎn)錄和表達的差異。結(jié)果△eha缺失株和互補株不溶血,而野生株溶血。eha基因的缺失降低E.tarda菌對過氧化氫的抵抗力,△eha缺失株較野生株的細胞毒性明顯減弱,eha基因可以調(diào)控遲緩愛德菌鞭毛基因的轉(zhuǎn)錄和表達。結(jié)論eha基因可以調(diào)控遲緩愛德華菌毒力基因的表達,是一個毒力調(diào)控基因。

遲緩愛德華菌;eha基因;基因缺失;基因調(diào)控

E.tarda屬于腸桿菌科愛德華菌屬是一種既感染動物又感染人的致病菌,特別會導致許多水生動物致病,給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來了很大的危害〔1〕。國內(nèi)外對 E.tarda的感染報道較多,但對其致病機制研究甚少,高大慶等通過鳥槍法,從 E.tarda中發(fā)現(xiàn)了一個新的溶血相關(guān)基因eha〔2-3〕,有關(guān)研究表明,eha不是溶血素結(jié)構(gòu)基因,而是激活大腸埃希菌中clyA(cytolysin A)基因的表達〔4〕。eha基因和傷寒沙門氏菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因slyA有68%同源性。因此,eha基因可能對 E.tarda其它基因具有調(diào)控作用。本研究利用自殺質(zhì)粒同源重組的方法,構(gòu)建△eha缺失株。通過比較 E.tarda野生株、△eha缺失株和互補株毒力方面的差異,分析eha對 E.tarda毒力的影響,有助于進一步理解 E.tarda的致病機制。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒和菌株 受體菌株,E.coil DH5α由本實驗室保存;E.coil SM 10(λpir)由中國疾病預(yù)防控制

中心的梁未麗教授惠贈;E tarda ET13株由南京農(nóng)業(yè)大學的陸承平教授惠贈;質(zhì)粒pACYC 184和自殺質(zhì)粒p HM 5均由本實驗室保存。

1.2 培養(yǎng)基 細菌培養(yǎng)選用LB(Luria Broth)培養(yǎng)基 抗生素使用濃度分別為:氨芐青霉素(Amp)100μg/m L,氯霉素 (Cm)50μg/m L,粘菌素 (Col)50μg/m L。

1.3 主要試劑 RNA提取試劑(Om iga公司);DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒(上海化舜公司);RT-PCR試劑 (TaKaRa公司);引物由上海英駿生物有限公司合成。

1.4PCR擴增 以提取 ET-13株基因組為模板,以F1-F:GAAGA TCTTA TTGCTGAGGGAACCGTCA和F1-R:GCTCTAGA CGTCGACCACTCGTACCAACCGTGA為引物序列,擴增 eha基因上游F1片段。以F2-F:GCTCTAGA TTTGGTAGA GCGA TTGGAAC和F2-R:CGAGCTCGCTTCT TAACCCACC GA TTT為引物序列,擴增eha基因下游F2片段。PCR反應(yīng)條件為:94℃3min,94℃30s,58℃(F1)52℃(F2)45s,72℃60s,擴增反應(yīng)為35個循環(huán),最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.5 重組自殺質(zhì)粒的制備 雙酶切F1和F2片段及自殺質(zhì)粒載體p HM 5,用膠回收試劑盒回收,16℃連接過夜,用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌SM 10(λpir)感受態(tài)細胞。在含AmprLB平板上挑取陽性克隆。提取重組自殺質(zhì)粒,酶切鑒定,命名為p HM-F。

1.6 缺失菌株構(gòu)建和鑒定 用接合的方法將重組自殺質(zhì)粒p HM-F從 SM 10λpi r轉(zhuǎn)移到 E.tarda ET13。在Ampr和ColrLB平板上,篩選含p HM-F的 ET13菌落。再通過二次交換,在Col和10%蔗糖的LB平板上,篩選到缺失株。再將缺失株反復(fù)穩(wěn)定傳代。另設(shè)計鑒定引物-F:GGCGTCTTACGCCGTTTAGC和鑒定引物-R:GTACCGA TGGGGTGCAGTTG,缺失株經(jīng) PCR擴增鑒定,命名為△eha缺失株。

1.7 互補菌株的構(gòu)建 以ET13株基因組DNA為模板,PCR擴增 eha基因的片段,引物序列為eha-F:CCAAGCTTTTGGAA TCGACA TTGGGCT和eha-R:CGGGA TCCTTA TTTA TTCTGTAAGTGA,eha基因和載體pACYC184連接,得到重組質(zhì)粒p ACEHA。通過電擊法將p ACEHA轉(zhuǎn)入到△eha缺失株,得到互補株,命名為ehaComp。

1.8 H2O2抗性紙片擴散法 一定濃度的細菌均勻涂到LB平板,再將不同濃度的 H2O2紙片置于平板上,16小時觀察結(jié)果,測量抑菌圈直徑(mm)。

1.9 溶血性分析 平板檢測法:參照文獻〔5〕,接觸溶血法將100μL過夜培養(yǎng)菌液,在“V”形96孔微量滴定板上與等體積1%兔紅細胞混合,37℃作用1h,用酶聯(lián)免疫檢測儀在OD540nm和OD600nm處測量各孔的吸光值,根據(jù)計算公式:溶血活性單位(hemolytic activity units,Hem.act.)= A 540/A 600×100(U)。上清檢測法將過夜培養(yǎng)菌液離心,上清過濾除菌,將100μL上清和等體積1%兔紅細胞混合,同上法測定上清的溶血性。

1.10 Vero細胞毒性試驗 取培養(yǎng)至OD600約0.8的菌液5 m L,離心 5 000g×30 min。上清經(jīng)過濾菌器過濾。同時收集對數(shù)期Vero細胞,至細胞單層鋪滿96孔底,分別加入10μL,50μL和100μL的濾液,再加 M TT溶液,用在酶聯(lián)免疫檢測儀在OD490nm處測量各孔的吸光值,計算Vero細胞的存活率。

1.11 酸化超速離心法法 取野生株和突變株的單個菌落接種至LB中,搖床(37±2)℃孵育過夜后,移種至500m L LB培養(yǎng)基中,放入恒溫搖箱 (37±2)℃孵育18～24 h,測定OD值,使其OD值基本一致。提取細菌鞭毛蛋白方法參考文獻〔6〕,分別溶于5 mL PBS,保存-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.12 SDS– PAGE蛋白電泳,檢測細菌鞭毛蛋白 ,方法參考文獻〔6〕。加樣量 15μL/每孔 ,在 1 ×Tris一甘氨酸凝膠電泳緩沖液中電泳。樣品在濃縮膠中的電泳電壓為80伏,在分離膠的電泳電壓為120伏。電泳后的凝膠置于考馬斯亮蘭 R-250染色液中染色過夜,脫色液脫色后觀察結(jié)果。

1.13 RT-PCR法 提取細菌 ET-13株總RNA,采用隨機引物,按照Promega公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作,逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。用引物 Flic-F:TAGAAGCAGGAAAA TGGGG和Flic-R:ACGC GGTAA TGCGCGA TAACG擴增鞭毛基因,同時擴增16SrRNA基因作為內(nèi)標參照,引物序列為16srRNA引物-F:TGAA GAAGGCCTTCGGGTTG和 16srRNA引物-R:TTACTAGCGA TTCCGACTTC,半定量檢測鞭毛基因的轉(zhuǎn)錄。

2 結(jié) 果

2.1 △eha缺失菌株的構(gòu)建及鑒定 本實驗構(gòu)建的自殺性重組質(zhì)粒p HM-F含有eha基因兩側(cè) F1和F2片段,將其通過接合轉(zhuǎn)入 E.tarda ET13株,其兩側(cè)片段與 ET-13株染色體上eha基因兩側(cè)片段可發(fā)生同源重組,質(zhì)粒上的Amp基因被隨之帶入 ET-13株中,在Ampr和 ColrLB平板上,篩選含p HM-F的 ET13菌落。在Col和10%蔗糖的LB平板上,篩選到自殺性質(zhì)粒脫離的△eha缺失株。

用 PCR擴增進一步鑒定突變株,即擴增片段478bp為缺失株,擴增片段825bp為野生株,PCR鑒定 。經(jīng)過十幾代傳代后,可得到穩(wěn)定的△eha缺失株。

2.2 互補株的構(gòu)建 根據(jù)eha基因序列設(shè)計Eha-F和 Eha-R為引物,以 ET-13的DNA為模板,擴增eha基因 432bp。用 Bam H I和 H in d III雙酶切產(chǎn)物,與載體pACYC184相同酶切產(chǎn)物連接,轉(zhuǎn)化E.coil DH5α,在氯霉素LB平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子,抽提重組質(zhì)粒進行酶切和PCR鑒定,重組質(zhì)粒命名為pACEHA。將該質(zhì)粒電擊入△eha缺失株,在氯霉素LB平板上獲得互補菌株,命名為ehaComp互補株。

2.3 溶血試驗 從圖1可以看出,野生株較△eha突變株和互補株在血平板有明顯溶血現(xiàn)象。

圖1 細菌血平板溶血現(xiàn)象Fig.1 The bacterial hemolytic crisis on blood plate 1.the△eha strains;2.the ET-13 wild strains;3.the comp lement strains

從表1可以看出,用接觸溶血(Contact Hemolysis,CH)法檢測,野生株的溶血活性明顯高于缺失株和互補株,有統(tǒng)計學意義(P<0.05),缺失株和互補株的溶血活性無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。用上清檢測(Supernatant A ssay,SA)法檢測,三種菌株均無溶血活性。

2.4 Vero細胞毒性實驗 細胞的存活率如表2所示。經(jīng)進行統(tǒng)計學分析,加入野生株與缺失株、互補株各 50μL濾液量時,細胞存活率有差異(P<0.05),加入50μL濾液,野生株與缺失株和互補株的細胞存活率差異明顯,說明缺失株和互補株較野生株分泌到培養(yǎng)基的細胞毒素少;而加入各10μL和100μL濾液量時,細胞存活率差異均不顯著。

2.5 RT-PCR 結(jié)果見圖2:分別以 ET-13野生株、△eha缺失株及ehaComp互補株的RNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板,同時擴增16SrRNA的基因和鞭毛基因 f lic。根據(jù)電泳結(jié)果,以擴增的16SrRNA基因為內(nèi)標參照,野生株和缺失株的擴增16SrRNA基因產(chǎn)物亮度基本一致前提下,野生株擴增f lic基因產(chǎn)物明顯亮于缺失株。互補株擴增16SrRNA基因的產(chǎn)物亮度強于野生株,但是互補株擴增出的 f lic基因產(chǎn)物卻明顯弱于野生株。

表1 細菌接觸溶血和細菌培養(yǎng)上清溶血性的結(jié)果Tab.1 The result of bacterial contact hemolysis and culture supernatant hemolysis

表2 細菌培養(yǎng)過濾液的Vero細胞毒性(M TT法)Tab.2 The Vero cell’cytotoxicity for the filtering culture of the bacteria by MTT

圖2 RT-PCR擴增鞭毛基因和16Sr RNA基因Fig.2 Amplification of the flagellar gene and 16SrRNA gene by RT-PCR 1.DNA marker;2,6.the ET-13 wild strains;3,7.the△eha strains;4,8.the comp lement strains;2-4.amp lification of the flagellar gene;6-8.amp lification of 16SrRNA gene

2.6 通過蛋白SDS-PAGE電泳檢測 結(jié)果見圖3條帶主要在43kD與56kD之間,與 E.tarda鞭毛蛋白分子量44kD一致。在 ET-13野生株和△eha缺失株細菌濃度一致的情況下,從野生株中提取的鞭毛蛋白FliC的量高于缺失株。

圖3 鞭毛蛋白的SDS-PAGE電泳1.蛋白marker;2.△eha缺失株的鞭毛蛋白;3.ET-13野生株的鞭毛蛋白Fig.3 The SDS-PAGE electrophoresis of the flagellin protein 1.protein marker;2.the flagellin proteins from△eha strains;3.the flagellin proteins from the ET-13 strains

2.7 H2O2紙片擴散實驗 通過測量抑菌環(huán)直徑,并對結(jié)果(圖4)進行統(tǒng)計學分析顯示,4個不同 H2O2濃度作用下,突變株的抑菌環(huán)直徑均大于野生株和互補株。抑菌環(huán)直徑與紙片 H2O2濃度呈現(xiàn)出正比趨勢。

3 討 論

病原細菌侵襲宿主細胞,產(chǎn)生毒力因子使宿主致病的過程,是一個緊密調(diào)控的過程。即病原細菌從感應(yīng)信號刺激,到接受刺激的調(diào)控子將激活或抑制相應(yīng)毒力因子靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達,這樣組成了一個毒力調(diào)控系統(tǒng)。為了能適應(yīng)各種環(huán)境,E.tarda菌已經(jīng)進化出了一些精細的毒力調(diào)控系統(tǒng)對環(huán)境作出適宜反應(yīng)。2009年中國科學家〔7〕公布了該菌EIB202菌株全基因組序列,測序結(jié)果表明:E.tarda菌染色體上存在和其他病原菌相似的毒力調(diào)控基因,如二元調(diào)控系統(tǒng)(Two-component Regulatory System s),密度感應(yīng)(Quorum Sensing),鐵攝取調(diào)控子(ferric up take regulato r,fur),Sly(Salmonella hemolysin,slyA)等,但這些毒力調(diào)控基因在 E.tarda菌中如何發(fā)揮作用,有待研究。在 Et-EIB202菌全基因組序列中,標簽為 ETAE-1684基因則直接稱為slyA,該基因序列和eha基因序列有100%同源性,即為eha基因。它和傷寒沙門氏菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因 slyA有68%同源性。slyA初次發(fā)現(xiàn)時,被認為它是一種新的溶血素基因,以后的研究表明,slyA不僅能調(diào)控傷寒沙門氏菌毒力二島 (Salmonella Pathogenicity island,SPI)等表面結(jié)構(gòu)基因,而且調(diào)控傷寒沙門氏菌中產(chǎn)生細胞毒性的膠原酶表達、抗菌肽耐藥性的產(chǎn)生,因此,slyA作為傷寒沙門氏菌重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控子〔8〕。雖然 eha和slyA都屬于 M arR〔9〕家族中的一員,它對 E.tarda其它基因是否具有調(diào)控作用,有待研究。

有研究〔10〕表明 E.tarda侵襲并進入宿主細胞,可能是由溶血素引起的。目前認為,至少存在兩種溶血素,一種是細胞結(jié)合性的溶血素,另一種是使細胞穿孔的分泌型溶血素。本研究顯示eha基因可以影響E.tarda毒素的產(chǎn)生,eha缺失后會影響細菌接觸性溶血和血平板的溶血現(xiàn)象,但是eha基因是否影響E.tarda其它毒素的產(chǎn)生及對何種溶血素的表達有作用,還有待研究。另外,鞭毛介導的運動能力被認為在 E.tarda致病早期起著重要作用,它使細菌穩(wěn)定地附著并在粘膜內(nèi)大量繁殖。flic基因控制細菌鞭毛素蛋白(flagellin)的產(chǎn)生,本研究表明eha基因可以影響f lic基因的轉(zhuǎn)錄和表達。

宿主在抵抗病原菌侵襲的過程中,其巨噬細胞可以產(chǎn)生對微生物殺傷的反應(yīng)性氧中間物,如H2O2等。本研究表明△eha缺失株相對于野生株對過氧化氫的抵抗力是降低的,所以eha基因可能影響 E.tarda在細胞內(nèi)的存活。

因此,eha基因調(diào)控了 E.tarda菌一些毒力基因的表達,是細菌的一種毒力轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。本研究通過探討eha基因調(diào)控E.tarda菌靶基因表達的機制,有助于加深對 E.tarda菌的宿主適應(yīng)力和致病機制的認識。

〔1〕Xiao J,Wang Q,Liu Q,et al.Isolation and identification of fish pathogen Edwardsiella tarda from mariculture in China〔J〕.Aquac Res,2008,40(1):13-17.

〔2〕高大慶,陸承平,吳守一,等.遲緩愛德華氏菌的溶血相關(guān)基因的克隆〔J〕.中國人獸共患病雜志,2000,16(5):51-52.

〔3〕高大慶,闞飆,陸承平,等.遲緩愛德華菌溶血相關(guān)基因的測序和初步的功能分析〔J〕.遺傳學報,2001,25(12):1162-1167.

〔4〕成靜,韓晶晶,印文靜,等.遲緩愛德華菌 eha基因?qū)Υ竽c埃希氏菌溶血基因cly A轉(zhuǎn)錄的調(diào)控〔J〕.中國人獸共患病學報,2007,23(12)15-18.

〔5〕高大慶,黃錫全,陸承平,等.遲緩愛德華氏菌的溶血特性的檢測〔J〕.中國人獸共患病雜志,2000,16(4):66-68.

〔6〕Morohoshi T,Yokoyama Y,OuchiM,et al.Motility and the expression of the flagellin protein FliC are negatively regulated by quorum sensing in Edw ardsiella tarda〔J〕.JBioscience Bioengineer,2009,108(4),314-318.

〔7〕Wang Q,Yang M.,Xiao J,et al.Genome sequenceof the versatile fish pathogen Edw ardsiella tarda provides insights into its adaptation to broad host ranges and intracellular niches〔J〕.PLos One,2009,4(10):e7646.

〔8〕Buchmeier N,Bossie S,Chen CY,et al.SlyA,a transcriptional regulator of Salmonella typhimurium,is required for resistance to oxidative stress and is expressed in the intracellular environment of macrophages〔J〕. Infect Immun,1997,65(9):3725-3730.

〔9〕Haque MM,Kabir MS,Kabir MS,et al.SlyA,a MarR family transcriptional regulator,isessential for virulence in Dickeya dadantii 3937〔J〕.JBacteriol,2009,191(17):5409-5418.

〔10〕Wang F,Zhang M,Hu YH,et al.Regulation of the Edw ardsiella tarda hemolysin gene and luxS by EthR〔J〕.J Microbiol Biotechnol,2009,19(8):765-773.

eha,a regulating virulence gene of Edw ardsiella tarda

ZHENG En-jin1,GAO Da-qing1,HONG Jie1,LU Cheng-ping2
(1.Southeast University;2 N anjing A gricultural University,N anning 210009,China)

To exp lo re the function of eha gene on regulating E.tarda virulence geneswhich was deleted by suicide plasmid p HM 5 from E.tarda.The△eha mutant strain wasobtained and the△eha comp lementary strain was constructed.Differences among the wild strains,mutant strains and comp lementary strains were compared by p late hemolysis,contact hemolysis and supernatant assay,respectively.The filtering cultures of the three kindsof E.tarda were used to test verocellcyto toxicity with M TTmethod.Comparisonsof the three kindsof E.tarda against hydrogen peroxidewere conducted by scrip diffusion and the bacterial flagellin protein was purified by acidification excessive speed centrifugation.The transcription and expression on the bacterial flagellin gene of them were also compared by RT-PCR and SDS-PAGE electropho resis.Results indicated that the mutant and comp lementary strains were non-hemolytic,while the wild strains were hemolytic.E.tarda decreased its resistance against hydrogen peroxide due to deletion eha and mutant strains produced less cytotoxicity than the wild ones.The transcription and expression of flagellin gene were regulated by eha gene.It’s concluded that eha gene p lays a regulato ry role on the expression of virulence gene of E.tarda and the eha gene was a regulating virulence gene of E.tarda.

E.tarda;eha gene;gene deletion;regulation

R378.2

A

1002-2694(2010)11-0999-05

＊東南大學人才引進科研啟動基金(No.4023001015)資助

高大慶,Email:dgao2@yahoo.com

1.東南大學醫(yī)學院,南京 210009;

2.南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,南京 210095;

2010-06-17;

2010-08-31