潘利敏,王月華,邊 東,郭登洲,王彥凱

(1.河北省中醫(yī)院腎內(nèi)科,河北石家莊 050011;2.石家莊長城體檢中心,河北石家莊 050017)

IgA腎病是我國最常見的原發(fā)性腎小球疾病,發(fā)病率較高,近年來觀察終末期腎衰竭患者中有26.69%的患者其原發(fā)病系 IgA腎病[1]。即使是IgA腎病發(fā)病率比較低的美國,20歲 ～39歲的成人中,IgA腎病仍占原發(fā)性腎小球疾病的第一位[2]。由于 IgA腎病的發(fā)病機制復(fù)雜、涉及的因素較多,因此到目前為止,尚無治療 IgA腎病的特效措施。我們根據(jù)中醫(yī)理論,探究本病病因病機,提出“益氣養(yǎng)陰化瘀祛濕法”,并依法組方腎炎寧治療 IgA腎病,臨床取得了較好的療效[3,4]。鑒于此,本研究試圖通過觀察腎炎寧對 IgA腎病血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelialgrowth factor,VEGF)的影響 ,以分析藥物的關(guān)鍵靶點和主要途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔型 Sprague-Dawley(SD)大鼠 48只,體重220g～260g,由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,動物合格證號 SCXK(冀)2008-1-003)。

1.2 實驗用藥

腎炎寧由黃芪、黨參、茯苓、白術(shù)、女貞子、旱蓮草、生地黃、白茅根、川芎、白花蛇舌草、三七粉、仙鶴草等組成,本院制劑室提供,按比例稱取后水煎濃縮至每毫升藥液含生藥量 3.82g;氯沙坦由杭州默沙東制藥有限公司提供,鹽酸貝那普利由北京諾華制藥有限公司提供。大鼠給藥劑量按藥理學(xué)實驗動物給藥方法計算,均以成人劑量(kg/d)的 10倍灌胃。

1.3 主要試劑

牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA),購自上海晶美生物科技有限公司,脂多糖(LPS,美國SIGMA公司),異硫氰酸(FITC)標(biāo)記羊抗大鼠 IgA抗體(Serotec公司),兔抗大鼠 VEGF抗體(博士德生物工程有限公司),SABC試劑盒(Vector公司)。

1.4 主要儀器

冰凍切片機(Bright,5030),熒光顯微鏡(Olympus BX60),醫(yī)學(xué)圖像定量分析系統(tǒng)(北京航天大學(xué))。

2 實驗方法

按隨機數(shù)字表法將實驗動物分為造模組 36只,正常組 12只,造模組參考湯穎等[5]IgA腎病造模改良方法,運用脂多糖 +牛血清白蛋白 +四氯化碳(CCl4)聯(lián)合造模:口服免疫原 BSA劑量較常用劑量增加 1倍,劑量 400mg/kg隔天灌胃,持續(xù) 6周;CCl4注射方式由既往的腹腔注射改為皮下注射,用誘導(dǎo)肝纖維化劑量的 1/3(皮下注射蓖麻油 0.5 ml+CCl40.1m l,每周 1次,持續(xù) 9周),并聯(lián)合運用 LPS(分別于第 6、8周以 LPS 0.05mg尾靜脈注射)。同時正常組給予蒸餾水灌胃,生理鹽水尾靜脈及皮下注射;9周后,將造模組動物按隨機數(shù)字表分成模型組、西藥組(貝那普利 +氯沙坦組)及中藥組(腎炎寧組)各 12只。中藥組及西藥組自第 9周起灌服成人劑量每公斤體重 10倍劑量,每天 1次,連續(xù) 6周。模型組及正常組以等量蒸餾水灌胃,所有大鼠在整個實驗期間均予以標(biāo)準(zhǔn)飲食。

3 檢測項目及方法

3.1 臨床指標(biāo)檢測

用代謝籠收集 24 h尿,并用按摩膀胱的方法采集新鮮晨尿,檢測 24 h尿蛋白及尿紅細胞。

3.2 腎組織病理

實驗結(jié)束時用水合氯醛麻醉大鼠,取外圍的腎皮質(zhì)一部分做冰凍切片行免疫熒光 IgA檢查,免疫熒光強度分級半定量標(biāo)準(zhǔn)參照國內(nèi)外通用的五級法分級:低倍鏡下不能顯示,高倍鏡下似乎可見為 ±;低倍鏡下似乎可見,高倍鏡下可見為 +;低倍鏡下可見,高倍鏡下清晰可見為 ++;低倍鏡下清晰可見,高倍鏡下耀眼為 +++;高倍鏡下刺眼為 ++++。另一部分做常規(guī)光鏡檢查,用 100ml/L的中性甲醛固定,石蠟包埋切片,分別做蘇木素-伊紅染色(HE),過碘酸-希夫染色(PAS)染色。PAS染色結(jié)果采用北京航天大學(xué) Motic Med6.0病理圖像分析系統(tǒng)分析,于 200倍光學(xué)顯微鏡下,PAS染色的腎組織每個切片標(biāo)本隨機計數(shù) 10個腎小球,用鼠標(biāo)標(biāo)出腎小球系膜區(qū)并計算面積,同時測出毛細血管叢面積,算出腎小球系膜區(qū)占整個毛細血管叢面積的百分比[6]。

3.3 免疫組化染色

腎組織 VEGF的表達采用免疫組化方法。應(yīng)用SABC法,采用多克隆兔抗大鼠 VEGF抗體,按說明書操作,陰性對照以 PBS代替一抗。免疫組化結(jié)果也采用北京航天大學(xué)病理圖像分析系統(tǒng)分析,每張切片隨機選 10個腎小球,測定其積陽性面積占整個腎小球面積的百分比(陽性面積/腎小球總面積),以每組的均值進行比較。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

全部數(shù)據(jù)采用 SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行處理,計量資料以均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差表示,計量資料用±s表示,組間差異采用單因素方差分析(One-way ANOVA),組間兩兩比較采用 SNK-q檢驗法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

5 結(jié)果

5.1 實驗大鼠一般表現(xiàn)

除正常組外,各實驗組大鼠在造模時均有不同程度的食欲減少、精神萎靡,且在注射脂多糖后第 2天情況加重。模型組在第 1次注射脂多糖后第 2天死亡 1只,第 2次注射脂多糖后第 2天死亡 2只,治療組亦是在 2次注射脂多糖后第 2天分別死亡 1只,死亡大鼠均已從實驗中剔除。

5.2 各組尿蛋白、尿紅細胞數(shù)變化

表1顯示,模型組和 2個治療組 24h尿蛋白定量與正常組相比,正常組明顯增加(P<0.01),而 2個治療組比模型組則有顯著下降(P<0.01),2治療組比較中藥組比西藥組又略有降低,但無統(tǒng)計學(xué)差異;而模型組和治療組的尿紅細胞計數(shù)與正常組相比明顯增多(P<0.01),西藥組比模型組有所下降,但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);中藥組與模型組相比顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

5.3 光鏡

表1顯示,正常組腎小球和腎小管形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。模型組腎小球系膜細胞輕度至中度增生,伴系膜基質(zhì)輕度至中度增多;腎小管上皮腫脹,內(nèi)有較多蛋白小滴。治療組個別節(jié)段系膜細胞輕度增生,系膜基質(zhì)輕度增多,部分腎小管上皮胞質(zhì)中有少量蛋白小滴,2個治療組之間差異不明顯。

5.4 腎組織免疫熒光

正常組腎小球系膜區(qū)無 IgA沉積。模型組表現(xiàn)為系膜區(qū)彌漫性顆粒狀 IgA沉積,個別呈團塊狀,熒光強度為 ++～+++,表明模型復(fù)制成功。2治療組 IgA沉積較模型組減輕,熒光強度為 +～++,腎炎寧組熒光強度略弱于西藥組。

5.5 VEGF免疫組化結(jié)果

表1、圖1顯示,VEGF表達于足細胞、系膜細胞及內(nèi)皮細胞、近曲小管上皮細胞內(nèi)。正常組有弱表達。與正常組相比,模型組及各治療組表達明顯增強。治療組 2組表達弱于模型組。

表1 各組 24h尿蛋白、尿紅細胞、系膜基質(zhì)沉積及 VEGF表達比較

表1 各組 24h尿蛋白、尿紅細胞、系膜基質(zhì)沉積及 VEGF表達比較

注:與正常組比較 :＊＊P<0.01;與模型組比較:P<0.05,P<0.01

組 別 例數(shù)尿蛋白(mg/24h)尿紅細胞(個/ul)系膜基質(zhì)(%)VEGF(%)正常組 12 9.55±1.72 9.11± 3.81 367.76±31.93＊＊ 5.94±1.66模型組 9 68.91±15.63＊＊ 341.35±24.56＊＊ 11.85± 4.38＊＊ 14.14±3.13＊＊西藥組 11 43.54±10.83＊＊ 95.13±25.81＊＊ 8.22± 1.61＊＊ 11.51±1.92＊＊中藥組 11 42.38±12.21＊＊ 3.77± 1.12 8.58± 2.23＊＊ 11.09±2.36＊＊

圖1 VEGF在各組的表達

6 討論

IgA腎病是 1組以 IgA或以 IgA為主的免疫復(fù)合物在腎小球系膜區(qū)沉積,臨床上以血尿、伴或不伴蛋白尿為常見表現(xiàn)的臨床病理綜合征。其發(fā)病率逐年遞增,隨著對 IgA腎病研究的日益深入,已知其預(yù)后并不樂觀。本病在中醫(yī)內(nèi)科中主要歸屬于“尿血 ”、“腰痛”、“水腫”范疇,多數(shù)患者起病隱匿,其發(fā)病與多種因素有關(guān)。但其基本病機是本虛標(biāo)實?！督饏T要略注》云:“五臟六腑之血,全賴脾氣統(tǒng)攝?！逼⒂薪y(tǒng)攝血流在經(jīng)脈中流行、防止溢出脈外的功能。脾的功能正常則血不會溢出脈外,反之,脾氣虧虛、統(tǒng)血不力,即可導(dǎo)致尿血。腎氣虛憊,失于封藏,也致尿血日久不愈,蛋白等精微物質(zhì)從尿中流失。腎陰虧虛,陰虛火旺,灼傷脈絡(luò)亦可見精微物質(zhì)從尿中流失。脾虛不能運化水濕,腎虛不能化氣行水,精微外泄而水液停滯,則見尿濁浮腫;病情繼續(xù)發(fā)展,氣血俱傷,脾腎失養(yǎng),濁毒內(nèi)停,三焦受阻,升降失常,水濕泛濫?！爸撂撝?便是留邪之地”,病程日久,腎之絡(luò)脈氣陰兩虛,氣虛無力運血而致血瘀;陰虛火旺,煎熬津液,津虧液少則血液黏稠不暢而致陰虛血瘀,腎絡(luò)瘀阻,致使腎體受損,腎用失司,導(dǎo)致本病的發(fā)生。總之,IgA腎病形成機理是非常復(fù)雜的,既有脾腎臟腑功能失調(diào)致氣陰兩虛,又有濕濁瘀血作祟。鑒于此我們提出“益氣養(yǎng)陰化瘀祛濕法”治療本病,并依法組方腎炎寧,臨床取得了較好的療效[3、4]。方中黃芪益氣固表、利水消腫,且黃芪大補宗氣,使氣旺血行。黨參、茯苓、白術(shù)補中、健脾、益氣、祛濕,白茅根、生地黃、女貞子、旱蓮草養(yǎng)陰補腎、涼血止血,川芎活血行氣,三七粉、仙鶴草活血止血。該方標(biāo)本兼顧、虛實并重,確能切中病機。

VEGF最先是在研究腫瘤的過程中被發(fā)現(xiàn)的,由于其強烈的促血管生長作用,故成為惡性腫瘤血管生成以及腫瘤轉(zhuǎn)移的研究熱點。近來研究發(fā)現(xiàn),VEGF與腎臟疾病之間有密切的關(guān)系。正常情況下VEGF可表達于足細胞與近曲小管上皮細胞,但在病理情況下,系膜細胞、內(nèi)皮細胞亦有表達[7,8]。Matsumoto等[9]報道了在 IgA腎病患者尿中 VEGF濃度較正常人明顯增高,且處于病變活動期的患者要高于靜止期的患者。師鎖柱等[10]報道 VEGF在IgA腎病進展過程中發(fā)揮復(fù)雜而重要的作用,涉及增加微血管通透性、誘導(dǎo)細胞外基質(zhì)合成、血管生成障礙等多種機制。Amemiya等[11]的研究未觀察到VEGF對系膜細胞有分裂效應(yīng),但 VEGF可增加系膜細胞膠原合成,具有劑量、時間依賴性。本次研究實驗結(jié)果表明,IgA腎病大鼠腎小球 VEGF蛋白表達較正常時增強,與文獻報道一致,提示 VEGF在IgA腎病病變中起到重要作用。腎炎寧方能明顯減少腎小球 VEGF表達,從而抑制細胞增生和細胞外基質(zhì)增多,延緩 IgA腎病腎小球病變進展。腎炎寧方組與西藥組(貝那普利 +氯沙坦組)比較,雖然沒有顯著性差異,但前者作用略優(yōu)于后者,提示腎炎寧方在抑制 IgAN大鼠 CTGF表達的途徑之外,可能對RAS也有阻斷作用,尚有待進一步證實。

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