張紅栓,賈鈺華,華何與,萬中原,關(guān)山越,曹世平,崔 凱

(1.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院,廣東廣州 510515;2.中山大學(xué)分析測試中心,廣東廣州 510275;3.南方醫(yī)院心內(nèi)科,廣東廣州 510515)

冠心病心絞痛是由于冠狀動脈供血不足,心肌急劇的、暫時的缺血與缺氧所引起的臨床綜合征,屬于中醫(yī)學(xué)胸痹、心痛等范疇。通過對 5099例冠心病心絞痛病例的 57種證候類型研究表明,單因素證候中血瘀最多,其他依次為痰濁、陽虛、氣虛、寒凝、血虛。

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等之后發(fā)展起來的以探討機體整體代謝狀態(tài)為目標(biāo)的新方法。疾病引起的機體代謝水平紊亂往往會在尿液和血液等體液的代謝組得到表現(xiàn)。因此,對尿液和血液等體液代謝組進(jìn)行檢測和分析,就有可能對疾病發(fā)生和發(fā)展過程伴隨的生物化學(xué)變化進(jìn)行了解和認(rèn)識,有可能發(fā)現(xiàn)相關(guān)疾病發(fā)生的早期代謝組標(biāo)志物簇并認(rèn)識相關(guān)的病理發(fā)生的分子機理,有可能對疾病在其早期甚至發(fā)生之前進(jìn)行診斷。本研究利用代謝組學(xué)技術(shù)對冠心病心絞痛痰濁證、血瘀證進(jìn)行了初步研究,試圖通過患者尿液代謝物質(zhì)的變化探索病證模式背后的生物標(biāo)記物。

1 研究對象

1.1 研究對象來源及分組

選擇 2008年 12月 ～2009年 9月在南方醫(yī)院心內(nèi)科患冠心病心絞痛(穩(wěn)定型、不穩(wěn)定型)的住院病人,經(jīng)選擇性冠狀動脈造影確認(rèn)為冠心病,經(jīng)主任中醫(yī)師辨證為痰濁證的患者 12例,血瘀證 12例。健康對照組為 6例通過體檢確定其身體健康的志愿者,無痰濁證、血瘀證表現(xiàn)。3組性別、年齡經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

冠心病心絞痛診斷標(biāo)準(zhǔn):參照國際心臟病學(xué)會和協(xié)會及世界衛(wèi)生組織臨床命名標(biāo)準(zhǔn)化聯(lián)合專題組報告《缺血性心臟病的命名及診斷標(biāo)準(zhǔn)》,并經(jīng)冠狀動脈造影確診。

痰濁證診斷標(biāo)準(zhǔn)。舌脈:舌苔胖大,邊有齒痕,苔濁膩或白滑,脈滑或數(shù)。主癥:心胸悶痛痞滿,胸悶重而心痛微。次癥:口黏乏味,納呆脘脹,頭身困重,痰多體胖。由主任中醫(yī)師辨證入組。

血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)。舌脈:舌紫暗,舌有瘀斑,舌下絡(luò)脈青紫,苔薄,脈弦澀或結(jié)代。主癥:心胸疼痛,如刺如絞,痛有定處,入夜為甚。次癥:怔忡不寧,面色晦暗,唇青紫,發(fā)枯膚燥。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

不符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)者;急性心肌梗死、心肌炎、心臟神經(jīng)官能癥、肋間神經(jīng)痛;其他疾病引起的心絞痛,如風(fēng)濕熱、梅毒、先天性冠狀動脈畸形、肥厚型心肌病、主動脈瓣狹窄或關(guān)閉不全者;合并有腦中風(fēng)、糖尿病、肺部感染、腎炎、腎功能衰竭、泌尿系感染、風(fēng)濕病、肝、腎、造血系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等嚴(yán)重疾病及骨關(guān)節(jié)病者;妊娠期或哺乳期患者,過敏體質(zhì)患者。

2 研究方法

2.1 儀器與試劑

儀器:美國瓦里安公司(Varian,Inc.)INOVA 500MHz超導(dǎo)核磁共振譜儀,配備脈沖場梯度,帶梯度場的三共振探頭;離心機:德國 Eppendorf MiniSpin Plus。

試劑:重水(D2O),美國 Cambridge Isotope Laboratories,Inc.公司,99.9%;氘代氯仿,美國Cambridge Isotope Laboratories,Inc.公司 ,99.8%;氘代甲醇,美國 Cambridge Isotope Laboratories,Inc.公司,99.8%;3-三甲基硅烷基-2,2,3,3-四氘代丙酸鈉(TSP),德國 Merck公司。

2.2 NMR實驗前的樣品配制

2.2.1 取材與處理

冠心病患者于入院第 2天(治療前)取清晨空腹時尿液 5m L,經(jīng) 13000r/min離心 10min。取上清3ml分裝,-80℃保存。健康人也取清晨空腹時尿液,方法同上。

2.3 NMR數(shù)據(jù)采集

尿液在室溫中解凍,取 500μl上清加入 250μl緩沖液(0.2mol/L Na2HPO4/NaH2PO4,pH=7.4),放置 10min,4℃,13000r/min離心 10 min。取上清液 500μl,添加 100μl的 TSP(1 mg/ml)混勻,轉(zhuǎn)入5mm核磁管中進(jìn)行測試。采用有預(yù)飽和的 1D NOESY脈沖序列,取如下參數(shù):譜寬 8000Hz,混合時間 0.15s,馳豫延遲時間 2s,采樣點數(shù) 32k,累加次數(shù) 64次;在馳豫延遲和混合期間采用預(yù)飽和方式抑制水峰,譜儀偏置設(shè)置在水峰的位置。自由感應(yīng)衰減信號經(jīng)過填零為 64k點之后,再加上 0.5Hz的線增寬因子,經(jīng)傅立葉變換轉(zhuǎn)換為 NMR圖譜。以 TSP為化學(xué)位移參考峰,設(shè)此為 0ppm。用 MNOVA軟件將所得譜圖進(jìn)行基線校正和相位調(diào)整,對 0.4ppm～9.4ppm的范圍進(jìn)行分段積分,每段為 0.04ppm,同時排除包含溶劑峰和尿素峰的部分(4.6ppm～6.2ppm)。將積分按每張譜的總積分強度歸一化。所得數(shù)據(jù)輸出并轉(zhuǎn)換到 Excel文件保存。

2.4 NMR數(shù)據(jù)分析

將保存的 Exeel格式數(shù)據(jù)輸入到 SIMCA-P+軟件(vl0.5,Umetrics,Umea,Sweden)進(jìn)行多元統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)采用平均中心化或 pareto標(biāo)度化進(jìn)行預(yù)處理之后,采用偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)。

3 結(jié)果

3.1 3組樣本的典型1H-NMR圖譜

冠心病心絞痛痰濁證、冠心病心絞痛血瘀證組尿液樣品的典型1H-NMR圖譜如下:

圖1 3組尿液樣本1H-NM R圖譜比較

表1 2組尿液樣本中主要差異代謝物

3.2 1 H-NMR圖譜模式識別分析

冠心病心絞痛痰濁證組與血瘀證組尿液樣本的1H-NMR譜的 PLS-DA分析結(jié)果見圖2。從積分圖可見,主成分積分值集中分布于橢圓形散點圖(95%置信區(qū)內(nèi))的 4個區(qū)域,2組間無明顯交叉和重疊。對1H-NMR譜變化值影響最大的 2個主成分對累積方差的貢獻(xiàn)率為 80.3%。積分圖上 2組樣本間沿 t軸方向能較好地分開,說明組間差異顯著。因子載荷圖結(jié)合原始圖譜可以找出差異代謝物的NMR峰化學(xué)位移值,2組尿液樣本中差異性代謝物見表1。

圖2 尿液代謝物 PLS-DA積分圖(A)、因子載荷圖(B)、三維空間圖(C)

3 討論

從1H-NMR圖譜及模式識別分析發(fā)現(xiàn),二組血漿樣本之間存在顯著的代謝產(chǎn)物譜差異:①2組的差異代謝物中與能量代謝有關(guān)的化合物有檸檬酸、α-酮戊二酸、順式-烏頭酸。檸檬酸與 α-酮戊二酸是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物,順式-烏頭酸是檸檬酸在烏頭酸酶作用下異構(gòu)化生成異檸檬酸的中間產(chǎn)物。痰濁證組上述物質(zhì)含量較高,血瘀證組較低,提示可能痰濁證組三羧酸循環(huán)的能量代謝水平高于血瘀證組;②差異代謝物中與糖代謝有關(guān)的化合物有 β-葡萄糖。痰濁證組尿液中的葡萄糖含量高于血瘀證組,提示可能痰濁證組比血瘀證組存在更嚴(yán)重的糖代謝紊亂;③差異代謝物中與脂代謝有關(guān)的化合物有 3-羥基丁酸、丙酮。3-羥基丁酸與丙酮都屬于酮體,酮體是脂肪分解的產(chǎn)物,糖代謝障礙和脂肪不完全氧化時酮體在體內(nèi)積聚使血酮升高,多余的酮體經(jīng)尿排出。痰濁證組的尿酮體含量比血瘀證組高,提示可能由于糖代謝紊亂導(dǎo)致的繼發(fā)性脂肪代謝紊亂比血瘀證嚴(yán)重;④差異代謝物中與氨基酸代謝有關(guān)的化合物有酪氨酸、組氨酸,二者均為非必需氨基酸。酪氨酸在促進(jìn)能量代謝、清除自由基、延緩疲勞等方面均有積極作用。組氨酸在人體中是組胺的前體,組胺能擴(kuò)張血管,降低血壓。痰濁證組的酪氨酸含量比血瘀證組高,組氨酸含量比血瘀證組低,可能提示血瘀證組氧自由基的增加與血管收縮比痰濁證組嚴(yán)重;⑤與腎功能變化相關(guān)的化合物有肌酐、氧化三甲胺。尿肌酐主要來自血液,經(jīng)過腎小球過濾后隨尿液排除體外,腎小管基本不吸收且排出很少。對于腎功能下降的患者而言,尿肌酐測定與血肌酐剛好相反,尿肌酐越高,一般說明腎臟排除肌酐毒素的功能越強。冠心病患者常同時合并高血壓和糖尿病,而后兩者常累及腎臟導(dǎo)致腎功能受損;同時冠心病患者也常伴有腎動脈粥樣硬化,引起頑固性腎血管性高血壓、腎組織梗死以及動脈粥樣硬化性固縮腎,從而導(dǎo)致腎功能下降。氧化三甲胺是一種反映腎臟問題的生物標(biāo)志物,有促進(jìn)肌肉組織生長的作用。痰濁證組尿液肌酐、TMAO含量比血瘀證組高,可能提示血瘀證組比痰濁證組更容易出現(xiàn)腎功能損害;⑥與肝膽、胃腸功能變化相關(guān)的化合物有膽汁酸、二甲胺、馬尿酸。膽汁酸作為膽汁的主要成分,可以反映肝臟分泌、肝臟合成與代謝、肝細(xì)胞損害的情況。一般而言,血中膽汁酸增高則尿中膽汁酸增高,提示肝功能受損。痰濁證尿液中尿膽汁酸含量較高,提示血瘀證組比痰濁證組更容易出現(xiàn)肝功能損害。二甲胺和馬尿酸來自于消化道微生物產(chǎn)生的腐敗產(chǎn)物,二者含量升高反映腸道微生物菌群的失調(diào),腐敗產(chǎn)物的增加可能是一些腸道疾病的原因。痰濁證組尿二甲胺和馬尿酸含量較高,提示痰濁證比血瘀證組更容易出現(xiàn)胃腸功能紊亂。既然心絞痛證型與腎肝膽脾胃功能有關(guān),正所謂“五臟六腑皆令心痛,非獨心也”,那么心痛病本在心,法當(dāng)調(diào)治本臟;若與其他臟腑有關(guān),法當(dāng)明辨標(biāo)本,調(diào)治相關(guān)臟腑;⑦本次試驗未解決的問題是,血瘀證組在化學(xué)位移為 0.60、0.48、0.40、0.44、8.80、9.24ppm處的未知化合物含量明顯高于痰濁證組。

冠心病心絞痛 2種證型的尿液1H-NMR圖譜能被區(qū)分并確定其中的差異代謝產(chǎn)物。它們與能量代謝、糖代謝、脂代謝、氨基酸代謝及肝腎胃腸功能的異常相關(guān),提示代謝組學(xué)方法檢測到的體內(nèi)小分子化合物的含量變化可能是中醫(yī)分型的物質(zhì)基礎(chǔ)。中醫(yī)學(xué)和代謝組學(xué)均是對影響機體整體狀況的多因素的研究對機體某一病理變化的全面情況進(jìn)行探究。二者之間理論上的關(guān)聯(lián)以及本研究的結(jié)果,為中醫(yī)辨證分型客觀化研究提供了新思路,為揭示中醫(yī)學(xué)證的本質(zhì)提供了新方法。