張 瑾,李春華,汪 凱,王烈成,尹 豆,張景行

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)睡眠研究室和生理教研室,安徽合肥 230032;2.南京軍區(qū)空軍機(jī)關(guān)醫(yī)院,江蘇南京 210018;3.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,安徽合肥 230022)

早在 20世紀(jì) 80年代末,就已證明 NO與心血管、免疫和神經(jīng)系統(tǒng)的功能調(diào)節(jié)有關(guān)。NO作為一種信使分子,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起著神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)質(zhì)的作用,參與了睡眠-覺(jué)醒周期、突觸可塑性,激素分泌等功能的調(diào)節(jié)[1]。近年來(lái)我們研究發(fā)現(xiàn),海馬是與睡眠密切相關(guān)的腦區(qū)[2],而海馬與 NO的關(guān)系亦十分密切:海馬的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)效應(yīng)被認(rèn)為是某些學(xué)習(xí)和記憶形式的基礎(chǔ),而 NO誘導(dǎo)的 cGMP水平的升高與 LTP有關(guān);在慢性應(yīng)激狀態(tài)下,內(nèi)源性的 NO具有抗抑郁的作用,而這一作用是通過(guò)刺激海馬的神經(jīng)發(fā)生實(shí)現(xiàn)的;當(dāng)受到神經(jīng)病理性損害如缺血時(shí),海馬是容易損傷的腦區(qū),而 NO與缺血損傷的進(jìn)程關(guān)系密切,且缺血損傷后的大鼠海馬 NO含量增加;海馬中含有豐富的一氧化氮合酶(NOS)陽(yáng)性神經(jīng)元。因此,既然海馬與睡眠密切相關(guān),而NO與海馬的關(guān)系又如此密切,海馬中的 NO是否與睡眠-覺(jué)醒的周期調(diào)節(jié)有關(guān),是一個(gè)令人十分感興趣的問(wèn)題。目前尚未見(jiàn)此方面的研究報(bào)道。本研究通過(guò)核團(tuán)內(nèi)注射不同的工具藥,通過(guò)自由活動(dòng)的在體模式下提取動(dòng)物的腦電波并作出分析,觀察了海馬中的 NO對(duì)大鼠睡眠-覺(jué)醒周期的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

健康成年 SD大鼠,雄性純種,體重 200g～250g,SPF級(jí),由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,大鼠分為實(shí)驗(yàn)組(L-NNA組、SNP組、L-Arg組、SNP+L-NNA組、L-Arg+L-NNA組)和對(duì)照組(NS組)。進(jìn)實(shí)驗(yàn)室后置透明有機(jī)玻璃圓筒(高 45cm,直徑25cm)內(nèi)單獨(dú)飼養(yǎng),活動(dòng)不受限制,自由攝食與飲水。所有大鼠均置于明/暗各 12h(光照 06∶00～18∶00時(shí))通風(fēng)環(huán)境中,室溫維持在 20℃～24℃。

1.2 藥品

戊巴比妥鈉由上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站分裝廠進(jìn)口分裝,臨用前用蒸餾水配置成 8 g·L-1溶液。L-NNA、SNP、L-Arg均為 Sigma公司的產(chǎn)品 ,所用劑量為 L-NNA 2.0μg;SNP 0.2μg;L-Arg 0.4μg,臨用前用生理鹽水配置,調(diào)節(jié) pH值至 7.4,以排除溶液的酸堿度變化對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。

1.3 手術(shù)

大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后,將其頭部固定于 SN-2型腦立體定位儀上,暴露顱骨,雙氧水清潔顱骨表面,按 Paxinos和 Watson大鼠腦立體定位圖譜確定雙側(cè)海馬插管位置(AP:-5.8mm、L/R:±5.0mm、H:7.0mm)。將 2根外徑為 0.6mm的不銹鋼引導(dǎo)管分別插入雙側(cè)海馬中,引導(dǎo)管頂端距海馬 1mm,供海馬內(nèi)微量注射藥物用。在冠狀縫前1mm及人字縫前 1mm與顱骨中線兩側(cè)旁開(kāi) 1mm交叉點(diǎn)處分別安裝銅質(zhì)螺絲釘,深度以穿透顱骨接觸到硬腦膜為度,用于記錄皮層腦電活動(dòng)。在雙側(cè)頸肌內(nèi)插入銀絲電極用于記錄肌電活動(dòng)。插管與記錄電極均以牙科水泥固定于顱骨上,并將腦電和肌電電極通過(guò)電線焊接至微型插座(法國(guó)產(chǎn))上。

圖1 海馬內(nèi)微量注射點(diǎn)和損毀點(diǎn)

1.4 睡眠描記及分析

記錄電極通過(guò)微型插座連接到 ND-82B型八導(dǎo)腦電儀上,同步記錄腦電和肌電活動(dòng),采用 30s為一分段時(shí)間,將睡眠-覺(jué)醒周期分為:①覺(jué)醒期(W):以額-頂葉引導(dǎo)出低幅快波腦電和明顯的肌電活動(dòng)為特征;②慢波睡眠(SWS):以睡眠梭形波和高幅慢波為特征,肌電活動(dòng)明顯減少,其中 δ波少于50%屬淺慢波睡眠(SWS1),超過(guò) 50%屬深慢波睡眠(SWS2);③異相睡眠(PS):以低幅快波為特征,除偶爾有肌肉抽動(dòng)外,無(wú)明顯肌電活動(dòng)。總睡眠時(shí)間(TST)為 SWS和 PS之和。

1.5 實(shí)驗(yàn)步驟

大鼠術(shù)后置隔音、自動(dòng)控制光照記錄室中休息1周。記錄前 1d將大鼠頭部微型插座通過(guò)引導(dǎo)線連接腦電儀,以適應(yīng)記錄狀態(tài)。在清醒待記錄狀態(tài)下進(jìn)行微量注射,用針尖外徑為 0.3mm的微量注射器通過(guò)引導(dǎo)管向核團(tuán)內(nèi)注射藥液(實(shí)驗(yàn)組)或生理鹽水(對(duì)照組)1μl,在 20 s內(nèi)注射完畢,留針 1min以防藥液溢出。每次描記從 09∶00開(kāi)始,連續(xù)記錄4h～6h,分析前 4h記錄。

1.6 組織學(xué)鑒定

大鼠在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用外徑為 0.3mm的單極不銹鋼電極插入引導(dǎo)管,通以 2.5mA陽(yáng)極直流電 10s電損毀被注射的核團(tuán),2d后各組大鼠取腦石蠟包埋,行 Nissl法染色,做組織學(xué)定位鑒定,觀察引導(dǎo)管軌跡頂部是否位于海馬,僅對(duì)定位準(zhǔn)確的大鼠實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 海馬內(nèi)微量注射 L-NNA對(duì)大鼠睡眠-覺(jué)醒周期的影響

海馬內(nèi)微量注射 L-NNA(2.0μg)引起 W減少,SWS增多,睡眠加深。與 NS組相比,L-NNA組 W減少 36.0%(P<0.001),SWS1、SWS2、SWS和 TST分別增加 21.7%(P<0.05)、113.4%(P<0.05)、31.4%(P<0.001)和 25.6%(P<0.001)。

2.2 海馬內(nèi)微量注射 SNP對(duì)大鼠睡眠-覺(jué)醒周期的影響

海馬內(nèi)微量注射 NO供體 SNP(0.2μg)使 W增多,SWS減少,睡眠變淺。與 NS組相比,SNP組 W增加 34.6%(P<0.01),SWS2、SWS和 TST分別減少 76.1%(P<0.05)、21.2%(P<0.01)和 24.5%(P<0.01)。

2.3 海馬內(nèi)微量注射 L-Arg對(duì)大鼠睡眠-覺(jué)醒周期的影響

海馬內(nèi)微量注射 NO的前體 L-Arg(0.4μg)對(duì)睡眠無(wú)直接影響。

2.4 海馬內(nèi)微量注射 SNP+L-NNA對(duì)大鼠睡眠-覺(jué)醒周期的影響

SNP預(yù)處理 30min后再注射 L-NNA,可阻斷 LNNA的促睡眠效應(yīng)。SNP+L-NNA(0.2μg+2.0μg)組與 NS組相比無(wú)顯著差異,與 L-NNA組相比,SNP+L-NNA組 W增加 56.3%(P<0.01),SWS2、SWS和 TST分別減少 65.0%(P<0.001)、22.7%(P<0.01)和 20.4%(P<0.01)。

2.5 海馬內(nèi)微量注射 L-Arg+L-NNA對(duì)大鼠睡眠-覺(jué)醒周期的影響

L-Arg預(yù)處理 30min后再注射 L-Arg可阻斷 LNNA的促睡眠效應(yīng)。L-Arg+L-NNA(0.4μg+2.0μg)組與 NS組相比無(wú)顯著差異,與 L-NNA組相比,L-Arg+L-NNA組 W增加 47.4%(P<0.01),SWS2、SWS和 TST分別減少 80.9%(P<0.001)、19.9%(P<0.01)和 17.3%(P<0.01)。

表1 海馬內(nèi)微量注射 L-硝基-精氨酸、硝普鈉、L-精氨酸對(duì)睡眠的影響(±s,min)

表1 海馬內(nèi)微量注射 L-硝基-精氨酸、硝普鈉、L-精氨酸對(duì)睡眠的影響(±s,min)

注:與生理鹽水組比較:＊P<0.05,＊＊P<0.01,＊＊＊P<0.001;與 L-NNA組比較:##P<0.01,###P<0.001

Group n W SWS1 SWS2 SWS PS TST NS 9 99.8±11.4 115.4±24.6 14.2±13.4 130.3±12.9 9.9±10.0 140.2±11.4 L-NNA 8 63.9 ±12.8＊＊＊ 140.0±16.7＊ 30.3 ±10.3＊ 171.2±15.5＊＊＊ 4.9± 7.0 176.1±12.8＊＊＊SNP 9 134.3±25.1＊＊ 99.3±21.9 3.4± 3.6＊ 102.7±23.7＊＊ 3.1± 3.0 105.8±25.1＊＊L-Arg 9 97.0±19.2 124.8±12.4 13.0±11.2 137.8±16.7 5.2± 5.4 143.0±19.2 SNP+L-NNA 8 99.9±22.1## 121.8±22.2 10.6± 6.3### 132.4±23.2## 7.7± 4.8 140.1±22.1##L-Arg+L-NNA 8 94.4±24.4## 131.4±24.2 5.8± 7.3### 137.2±26.0## 8.4± 6.2 145.6±24.4##

3 討論

從 19世紀(jì)開(kāi)始,有關(guān)睡眠發(fā)生的腦機(jī)制以及和催眠有關(guān)的物質(zhì),截止目前尚有許多問(wèn)題需要進(jìn)一步深入研究。本研究室曾系統(tǒng)地對(duì)杏仁核、中縫背核、下丘腦腹外側(cè)視前區(qū)、丘腦網(wǎng)狀核等腦區(qū)在睡眠調(diào)節(jié)中的作用進(jìn)行過(guò)研究。近年來(lái)的諸多研究表明,海馬與睡眠調(diào)節(jié)的關(guān)系十分密切,如經(jīng)短期睡眠剝奪的大鼠,其海馬中某些蛋白質(zhì)高度地表達(dá);海馬齒狀回含有能分化為神經(jīng)元的祖細(xì)胞。有研究發(fā)現(xiàn),剝奪成年大鼠 96h的睡眠(慢波睡眠和快波睡眠均剝奪)后,其海馬齒狀回的神經(jīng)發(fā)生受到抑制,特異性地剝奪快波睡眠后亦能產(chǎn)生相似的結(jié)果;海馬與中縫核、杏仁核、藍(lán)斑、丘腦、下丘腦等調(diào)節(jié)睡眠的神經(jīng)結(jié)構(gòu)間有著復(fù)雜的纖維聯(lián)系;海馬中含有許多與睡眠調(diào)節(jié)相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì),如 5-羥色胺(5-HT)、乙酰膽堿(ACh)、去甲腎上腺素(NA)等,本研究室也曾報(bào)道過(guò)海馬參與睡眠調(diào)節(jié)的相關(guān)研究結(jié)果。

NO作為一種信使分子,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起著神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)質(zhì)的作用,參與了睡眠-覺(jué)醒周期、突觸可塑性、激素分泌等功能的調(diào)節(jié)。SNP為 NO的供體,在體內(nèi)能自發(fā)釋放 NO,其釋放量與 NOS活性無(wú)關(guān)。L-Arg為 NO的前體,在 NOS作用下可生成 NO。本研究發(fā)現(xiàn),海馬內(nèi)微量注射 L-NNA可使覺(jué)醒減少,慢波睡眠增多,睡眠加深;微量注射 LArg對(duì)睡眠無(wú)直接影響,但可阻斷 L-NNA的促睡眠效應(yīng);微量注射 SNP使覺(jué)醒增多,慢波睡眠減少,睡眠變淺,并可阻斷 L-NNA的促睡眠效應(yīng),表明抑制海馬中內(nèi)源性 NO生成具有減少覺(jué)醒和增加慢波睡眠的效應(yīng),而海馬中外源性 NO釋放則引起增加覺(jué)醒和減少慢波睡眠的效應(yīng)。結(jié)果提示,NO在海馬可能發(fā)揮著促覺(jué)醒的作用。1997年 Burlet等報(bào)道用電壓感受計(jì)檢測(cè)大鼠腦中 NO的濃度,發(fā)現(xiàn)大鼠清醒時(shí)信號(hào)強(qiáng)度增高,而在慢波睡眠和快波睡眠期明顯降低;同年 Williams等用微透析及血紅蛋白捕捉技術(shù),測(cè)定大鼠丘腦細(xì)胞外 NO在睡眠-覺(jué)醒周期中的變化,發(fā)現(xiàn) NO在腦電去同步化狀態(tài)(清醒及快波睡眠)時(shí)合成最快,而在慢波睡眠期顯著降低;Marino等用伏安發(fā)檢測(cè)大鼠腦內(nèi) NO的濃度,亦發(fā)現(xiàn) NO在覺(jué)醒期合成最快,而在慢波睡眠及快波睡眠期明顯降低,以上報(bào)道均支持我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。NO參與睡眠調(diào)節(jié)的另一方面有力證據(jù)是:NO激活可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶(sGC),升高細(xì)胞 cGMP水平,是 NO多種生物效應(yīng)的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,那么海馬中 NO對(duì)睡眠的調(diào)節(jié)作用是否與 cGMP有關(guān)呢?Ribeiro等研究發(fā)現(xiàn),在大鼠腦室內(nèi)注射 8-Br-cGMP(一種可透過(guò)膜的 cGMP的類似物)可促進(jìn)覺(jué)醒,抑制快波睡眠和慢波睡眠,提示 cGMP參與了睡眠的調(diào)節(jié),故我們推測(cè)海馬中的 NO可能是通過(guò)激活鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶使 cGMP濃度升高而發(fā)揮其抑制 SWS作用的,我們?cè)鴪?bào)道 cGMP水平升高具有促進(jìn)覺(jué)醒,抑制慢波睡眠的作用,與本研究結(jié)果相符合。

有研究表明,NO在衰老過(guò)程中發(fā)揮了一定的作用,在衰老過(guò)程中組織產(chǎn)生的 NO降低,可能是導(dǎo)致老年人容易患記憶減退、老年性癡呆等腦功能障礙性疾病的重要原因之一,提示我們老年人的睡眠質(zhì)量下降,特別是深慢波睡眠的減少,與組織 NO含量的變化似乎不無(wú)關(guān)系。而本研究發(fā)現(xiàn),海馬中NO含量降低可以使睡眠加深,提示海馬中 NO參與了深慢波睡眠的調(diào)節(jié),因而本研究在一定程度上從有可能影響 NO和 cGMP代謝的化學(xué)物質(zhì)的角度,為臨床尋找到理想、新型的催眠藥物提供了可借鑒的思路和一定的實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

我們知道睡眠的調(diào)節(jié)不是單一的某個(gè)中樞的功能,它涉及多級(jí)腦中樞的相互聯(lián)系,因此增加了探討睡眠機(jī)制的復(fù)雜性。海馬中 NO對(duì)睡眠-覺(jué)醒周期的調(diào)節(jié)中,NO與其他遞質(zhì)的協(xié)同作用也可能參與其中發(fā)揮作用。海馬內(nèi)的 NO能調(diào)節(jié)多種神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,如 5-羥色胺、乙酰膽堿、多巴胺等,而本研究室亦曾系統(tǒng)探討過(guò)這些遞質(zhì)在睡眠-覺(jué)醒周期調(diào)節(jié)中的重要作用,具體的相關(guān)機(jī)制有待我們?cè)诮窈蟮墓ぷ髦凶鲞M(jìn)一步的研究和探討。

[1]Calabrese V,Mancuso C,Calvani M,et al.Nitric oxide in the central nervous system:neuroprotection versus neurotoxicity[J].Nat Rev Neurosci,2007,8(10):766-775.

[2]李春華,張瑾,趙樂(lè)章,等.海馬中 5-羥色胺對(duì)慢波睡眠的影響[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2006,12(11):844-845.