林 蘭,劉繼斌

(1.南通市腫瘤醫(yī)院檢驗科,江蘇南通 226361;2.南通市腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所,江蘇南通 226361）

中晚期消化系惡性腫瘤 CIK細胞治療前后免疫功能變化的價值

林 蘭1,劉繼斌2

(1.南通市腫瘤醫(yī)院檢驗科,江蘇南通 226361;2.南通市腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所,江蘇南通 226361）

目的探討經(jīng)CIK細胞治療的中晚期消化系惡性腫瘤患者治療前后外周血淋巴細胞多種免疫指標(biāo)的變化及在CIK細胞治療效果評估中的價值。方法采用流式細胞術(shù)檢測53例中晚期消化系惡性腫瘤和 30例健康體檢者外周血中 8種免疫指標(biāo)變化,并比較分析 53例中晚期消化系惡性腫瘤患者應(yīng)用CIK細胞治療前后 8種免疫指標(biāo)的表達。結(jié)果中晚期消化系惡性腫瘤患者免疫功能低下 (P＜0.05）;患者CIK細胞治療前后 CD 4、CD 19、CD3/CD 16+CD 56比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。結(jié)論采用流式細胞術(shù)檢測外周血免疫指標(biāo)的變化為臨床觀察中晚期消化系惡性腫瘤患者CIK細胞治療前后免疫狀態(tài)變化提供了有效的依據(jù);CIK細胞治療可激活T淋巴細胞而改善免疫功能;外周血免疫指標(biāo)可用于治療效果的評價。

中晚期消化系惡性腫瘤;CIK細胞;流式細胞術(shù);淋巴細胞

細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞(cytokine induced killers,CIK）在體外可大量擴增,并具有一定的抗腫瘤效應(yīng)。與其他抗腫瘤藥物相比,CIK細胞可以在不損傷機體免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的前提下,直接殺傷腫瘤細胞,并可調(diào)節(jié)和增強機體的免疫功能。本觀察采用流式細胞術(shù)檢測淋巴細胞的一些表面抗原在中晚期消化系惡性腫瘤患者外周血中的表達,并探討 CIK細胞治療前后患者免疫功能改變,以期為評估 CIK細胞治療效果提供有效的試驗數(shù)據(jù)。2003年 10月至 2009年 3月共有 53例中晚期消化系惡性腫瘤在我院接受CIK細胞治療,現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 惡性腫瘤組 53例中晚期消化系惡性腫瘤,均經(jīng)影像學(xué)、細胞學(xué)及病理學(xué)檢查等確診;其中男性 33例,女性 20例;年齡 31～76歲,平均年齡 56歲,其中 40～60歲者占 92.4%;根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟分期標(biāo)準(zhǔn)進行臨床分期,其中Ⅰ ～Ⅱ期 5例(9.4%）,Ⅲ～Ⅳ期 48例(90.6%）;腫瘤類型:食管癌 16例,肝癌13例,結(jié)腸癌 10例,胃癌 12例,胰腺癌 2例。對照組30例為健康體檢者,其中男性 16例,女性 14例;年齡30～52歲,平均年齡 41歲。兩組年齡和性別構(gòu)成比比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05）。

1.2 CIK細胞的制備及回輸 采用 Ficoll密度梯度離心法分離異體外周血單個核細胞,用 RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌 3次,將細胞按 2×106m L-1的濃度懸浮于RPMI-1640培養(yǎng)基中。參照美國斯坦福大學(xué)骨髓移植中心建立的 CIK細胞培養(yǎng)方法:第 0天加入 IFN-γ500 u/mL,置于 37℃、體積分?jǐn)?shù) 5%CO2孵箱中培養(yǎng) 24h,第 1天加入 IL-2 300 u/mL、CD3 10 μg/m L、IL-1 100 u/mL繼續(xù)培養(yǎng),觀察細胞生長,并根據(jù)情況進行擴增。以后每 3 d換液 1次并調(diào)整細胞數(shù)為 2×106m L-1,置于 37℃、體積分?jǐn)?shù) 5%CO2孵箱中連續(xù)培養(yǎng)10～12 d后用臺盼藍計數(shù)。CIK細胞培養(yǎng) 14～28 d后,取少許培養(yǎng)細胞做流式細胞術(shù)檢測,當(dāng) CD3+CD56+細胞數(shù) ≥50%,CD3+CD8+細胞≥30%,且微生物學(xué)檢查陰性時收集細胞。經(jīng)生理鹽水洗滌 3次,加入含質(zhì)量分?jǐn)?shù) 1%人血白蛋白生理鹽水中回輸體內(nèi),1次 /d,5 d為 1個療程[1]。

1.3 材料與儀器 小鼠抗人單克隆抗體 CD4/CD8/CD3、CD19、CD3/CD16+CD56及同型對照,紅細胞裂解液均購自蘇州基因公司。流式細胞儀為美國 Beckman Coulter公司產(chǎn)品。

1.4 檢測方法 采取直接免疫熒光標(biāo)記全血溶血法,用流式細胞儀測定腫瘤患者外周血淋巴細胞表面抗原的表達,具體步驟如下。淋巴細胞表面標(biāo)記:取熒光標(biāo)記單克隆抗體 CD4/CD8/CD3、CD3/CD16+CD56、CD19各 10μL放入試管中,分別加入外周全血 100 μL,室溫避光孵育 15min,并作同型對照;溶血:加入Optilyse C溶血劑 500 mL,混勻,室溫避光 10m in;洗滌:以 1 500 r/min的速率離心 5min,棄上清液,加入PBS 1 mL,混勻,重復(fù)洗滌 1次;重懸:加入 PBS 1 mL,混勻,制成單細胞懸液;檢測:上流式細胞儀,每個樣品檢測 5 000個以上的細胞,用軟件分析計算淋巴細胞中各標(biāo)記細胞的比例。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用 SPSS10.0軟件進行分析。計數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)表示,比較采用 χ2檢驗;計量資料用±s表示,比較采用t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組免疫指標(biāo)的表達情況 惡性腫瘤組 53例中晚期消化系惡性腫瘤與對照組 30例健康體檢者的各免疫指標(biāo)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）,提示中晚期消化系惡性腫瘤患者的免疫功能低下。詳見表1。

表 1 惡性腫瘤組與對照組各免疫指標(biāo)的比較(±s）

表 1 惡性腫瘤組與對照組各免疫指標(biāo)的比較(±s）

注:1）與對照組相比,P＜0.05

組別 例數(shù) CD 3 CD 4 CD8 CD19 CD 3/CD 16+CD 56對照組 30 59.52±48.44 39.24±8.36 24.14±9.36 11.75±3.76 17.21±7.42惡性腫瘤組 53 54.12±47.471） 35.34±5.351） 22.14±8.271） 8.98±1.451） 12.27±5.591）

2.2 惡性腫瘤組治療前后免疫指標(biāo)的變化 CIK細胞治療前與CIK細胞治療后相比,惡性腫瘤組 53例中晚期消化系惡性腫瘤的 CD3差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05）,CD4差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）,CD8差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05）,CD19差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）,CD3/CD16+CD56差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。詳見表 2。

表2 CIK細胞治療前后惡性腫瘤組各免疫指標(biāo)變化(±s）

表2 CIK細胞治療前后惡性腫瘤組各免疫指標(biāo)變化(±s）

注:1）與治療前相比,P＜0.05

組別 例數(shù) CD 3 CD 4 CD8 CD19 CD 3/CD 16+CD 56 CIK治療前 53 54.12±47.47 35.34±5.35 22.14±8.27 8.98±1.45 12.27±5.59 CIK治療后 53 60.23±51.55 39.56±6.671） 21.24±5.68 12.45±1.781） 19.23±8.121）

3 討論

惡性腫瘤患者通常免疫功能狀態(tài)紊亂、低下,而免疫功能狀態(tài)在一定程度上可預(yù)示腫瘤的發(fā)展和預(yù)后[2]。眾所周知,機體的細胞免疫由 T淋巴細胞介導(dǎo),T淋巴細胞的主要功能是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)抗原引起的所有免疫應(yīng)答,并具有清除細胞表面抗原或細胞內(nèi)微生物的效應(yīng)作用。CIK細胞是患者外周血單個核細胞在體外經(jīng)過多種細胞因子共同誘導(dǎo)而獲得的以CD3+CD8+細胞毒性 T淋巴細胞和 CD3+CD56+T淋巴細胞為主的異質(zhì)細胞群,兼具有 T淋巴細胞強大的抗腫瘤活性和 NK細胞非 MHC限制性殺瘤活性,且體內(nèi)外增殖能力強,是一類殺瘤活性和殺瘤譜更強的新型抗腫瘤效應(yīng)細胞[3-5]。目前,國內(nèi)外制備的用于過繼免疫治療的 CIK細胞實際是體外擴增出的以CD3+CD56+、CD3+D8+T淋巴細胞為主的異質(zhì)性細胞群,體內(nèi)回輸 CIK細胞,可以在不損傷機體免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的前提下,直接殺傷腫瘤細胞,并可調(diào)節(jié)和增強機體的免疫功能[6-7]。

以往,腫瘤的診斷及預(yù)后的判斷主要依據(jù)病理學(xué)檢查,這種方法缺乏定量分析,且易受主觀影響。而機體的免疫功能狀態(tài)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān),免疫功能較好的患者,預(yù)后相對較好,反之亦反;因此,檢測患者免疫指標(biāo)有助于判斷病情和指導(dǎo)治療[8]。本觀察結(jié)果顯示,患者組各免疫指標(biāo)明顯低于對照組,這表明中晚期消化系惡性腫瘤患者的免疫功能低下,且NK細胞的殺傷活性較低,與文獻報道一致[9]。惡性腫瘤組 CIK細胞治療前后各免疫指標(biāo)的變化情況提示,經(jīng)過免疫治療后,體內(nèi)腫瘤細胞分泌的可溶性免疫抑制因子減少,同時機體通過 T淋巴細胞的免疫應(yīng)答,導(dǎo)致 CD4+T細胞活性加強,調(diào)節(jié)激活了 T淋巴細胞、B淋巴細胞、NK細胞的功能,從而改善了機體的細胞免疫功能;治療后相關(guān)免疫活性細胞如 T淋巴細胞、B淋巴細胞和 NK細胞數(shù)量呈上升趨勢,這與治療后瘤體有不同程度縮小相吻合。本觀察結(jié)果還提示,惡性腫瘤患者的免疫功能存在缺陷,而 CIK細胞治療可改善患者 T淋巴細胞的數(shù)量和比例;同時,亦可直接刺激T淋巴細胞的活化,增強機體細胞和體液免疫功能。

綜上所述,采用流式細胞術(shù)檢測外周血免疫指標(biāo)的變化為臨床觀察中晚期消化系惡性腫瘤患者 CIK細胞治療前后免疫狀態(tài)變化提供了有效的依據(jù);CIK細胞治療可激活 T淋巴細胞而改善免疫功能;外周血免疫指標(biāo)可用于治療效果的評價。

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The Changes of Immune Function in Patients with Advanced Digestive Tract Cancer Treated by CIK Cells

Lin Lan1,Liu Jibin2
(1.Departmentof Clinical Laboratory,Nantong Tumor Hospital,Nantong 226361,China;2.The Institute ofOncology,Nantong Tumor Hospital,Nantong 226361,China）

ObjectiveTo investigate the changes ofmultip le immune indexes in peripheral blood of patients with advanced digestive tract cancer and the clinical valueof the indexes for the effectof the CIK cells treatment.MethodsFlow cytometrywas employed for determ ining the 8 indexes of 53 patientswith advanced digestive tract cancer and 30 healthy persons.The exp ression results beforeand after the CIK cells treatment of 53 patients were compared.ResultsThe immune function of patients with advanced digestive tract cancers were low(P＜0.05）.For the 53 patientswho

CIK cells treatment,the CD4,CD 19 and CD 3/CD16+CD56after the treatmenthad statistic differences compared by those before the treatment(P＜0.05）.ConclusionDeterm ining the immune indexes by flow cytometry provides an effective basis for evaluating the immune function of patients with advanced digestive tract cancer.CIK cells treatment can activate T lymphocyte,so as to imp rove immune function.

advanced digestive tract cancer;CIK cells;flow cytometry;lymphocyte

R 735;R 730.54

A

1673-5412(2010）05-0399-03

林蘭(1969-）,女,主管檢驗師,主要從事腫瘤臨床檢驗及相關(guān)工作。E-mai:ntzlyyl2010@163.com

劉繼斌(1974-）,男,副主任技師,主要從事腫瘤的臨床檢驗診斷研究。E-mail:tians2008@163.com

2010-07-12）