朱志杰,黃修明,鄺繼孫,谷 淵,董 星,趙龍栓

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽胰脾外科,河南省高等學(xué)校肝膽胰外科與消化器官移植重點學(xué)科開放實驗室,河南鄭州 450052）

GADD45β和 survivin基因在人原發(fā)性肝癌組織中的蛋白表達及意義

朱志杰,黃修明,鄺繼孫,谷 淵,董 星,趙龍栓

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽胰脾外科,河南省高等學(xué)校肝膽胰外科與消化器官移植重點學(xué)科開放實驗室,河南鄭州 450052）

目的探討GADD45β和survivin基因在人原發(fā)性肝癌(HCC）組織中的蛋白表達及意義。方法收集不同分化程度的HCC組織標本 68例,正常肝組織標本 20例,采用免疫組化S-P法檢測 GADD 45β和 survivin基因的蛋白表達。結(jié)果GADD 45β基因與survivin基因在 HCC組織中的蛋白表達率分別為 38.24%(26/68）和 75.00%(51/68）,兩者的表達均與 HCC的病理分化程度、臨床分期有關(guān)(P＜0.05）,survivin基因的表達還與門脈癌栓有關(guān)(P＜0.05）。隨著 survivin基因在 HCC組織中蛋白表達率的升高,GADD45β基因蛋白表達強度明顯下降,兩者的表達呈負相關(guān)(r=-0.454,P＜0.05）。結(jié)論GADD 45β基因在HCC發(fā)生發(fā)展中起抑制作用,GADD 45β基因表達缺失是HCC發(fā)生發(fā)展的重要因素之一;survivin基因的異常表達在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起促進作用。聯(lián)合檢測 GADD 45β基因和survivin基因的蛋白表達有助于判斷 HCC的惡性程度和HCC患者的預(yù)后。

生長阻滯和 DNA損傷誘導(dǎo)基因;survivin基因;原發(fā)性肝癌;免疫組化

人原發(fā)性肝癌(human hepatocellular carcinoma,HCC）的發(fā)生是一個多基因參與并通過不同基因在不同時相的差異性表達進行調(diào)控的復(fù)雜過程[1]。細胞DNA損傷誘導(dǎo)生長阻滯和 DNA損傷誘導(dǎo)基因(growth arrest DNA damage-inducible gene 45β,GADD 45β）表達使細胞發(fā)生 G2/M期阻滯,調(diào)節(jié)細胞凋亡和存活等多條信號通路,GADD45β在決定細胞存活中發(fā)揮著重要作用[2]。survivin是1997年由 Ambrosini發(fā)現(xiàn)的一種細胞凋亡抑制因子,在胚胎發(fā)育過程中出現(xiàn),在終末分化的成人組織中無表達(胸腺除外）,而在轉(zhuǎn)化細胞株和人體內(nèi)幾乎所有的惡性腫瘤組織中均有明顯表達[3]。本研究應(yīng)用免疫組化法檢測正常肝組織和不同病理分化程度的HCC組織中GADD45β基因與survivin基因的蛋白表達水平,并探討兩者的關(guān)系及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集我院 2009年 1月至 2009年 8月手術(shù)切除并經(jīng)病理證實的 HCC 68例,術(shù)前均未接受化療及放療,其中男性 37例,女性 31例,年齡 31～79歲,平均年齡(46±7.2）歲。另取 20例正常肝組織作為對照,其中男性 12例,女性 8例,年齡 29～75歲,平均年齡 (49±4.7）歲。68例 HCC中,AFP≥400μg/L 43例 ,AFP＜400μg/L 25例 ;瘤徑≥5 cm 24例,瘤徑 ＜5 cm 44例;包膜完整 37例,包膜不完整或無包膜 31例;有脈管癌栓 21例,無脈管癌栓 47例;臨床分期Ⅰ ～Ⅱ期 33例,Ⅲ期 35例;病理分化程度低分化 29例,中高分化 39例。

1.2 試劑 GADD45β基因表達診斷試劑盒、survivin基因表達診斷試劑盒、S-P免疫組化試劑盒、DAB試劑盒及

陽性參考切片均購自北京中杉金橋生物工程有限公司。

1.3 方法 GADD45β基因與 survivin基因表達檢測均采用免疫組化 S-P法,標本為 4μm石蠟標本切片,嚴格按照試劑盒說明操作。陽性對照為已知陽性切片,滴加 PBS液代替一抗的切片作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判定 顯微鏡下觀察免疫組化染色后的病理切片,兩者的陽性反應(yīng)均為細胞質(zhì)內(nèi)黃色、棕黃色顆粒,對每張病理切片隨機計數(shù) 5個視野(×200）中GADD 45β基因和 survivin基因的陽性表達細胞比率。(-）為全部陰性表達或陽性表達細胞比率 ＜5%;(+）為陽性表達細胞比率 6%～20%;(++）為陽性表達細胞比率 21%～50%;(+++）為陽性表達細胞比率 ＞50%[4]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用 SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,率的比較采用 χ2檢驗或 Fisher精確概率法,相關(guān)分析采用Spearman等級相關(guān)分析法,檢驗水準 α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 GADD45β基因與 survivin基因在 HCC及正常肝臟組織中的蛋白表達 GADD45β基因表達在細胞漿,陽性表現(xiàn)為彌漫性棕黃染色。HCC組織中 GADD45β基因的蛋白陽性表達率為 38.24%(26/68）,明顯低于正常肝組織的 85.00%(17/20）(P＜0.05）。survivin基因表達在細胞漿,偶可見于細胞核,陽性表現(xiàn)為顆粒樣棕黃染色。HCC組織中 survivin基因的蛋白陽性表達率 75.00%(51/68）,明顯高于正常肝組織的25.00%(5/20）(P＜0.05）。見表 1。

表 1 Gadd45β基因和 survivin在 HCC組織及正常肝組織中的蛋白表達(例）

2.2 GADD45β基因與 survivin基因的蛋白表達與HCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系 GADD45β基因與 survivin基因在HCC組織中的蛋白表達均與腫瘤病理分化程度及臨床分期有關(guān)(P＜0.05）;survivin基因的蛋白表達還與門脈癌栓有關(guān)(P＜0.05）;兩者的表達與 HCC腫瘤大小、有無包膜、血清 AFP濃度均無關(guān)(P＞0.05）。見表 2。

表 2 Gadd45β基因和 survivin基因的蛋白表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 HCC組織中 GADD45β基因與 survivin基因的蛋白表達的關(guān)系 HCC組織中 GADD45β基因與 survivin基因蛋白表達均為陽性者占 17.65%(12/68）。GADD45β基因蛋白表達陽性者的 survivin基因蛋白表達陽性率為 46.15%(12/26）,GADD 45β基因蛋白表達陰性者的 survivin基因蛋白表達陽性率為92.86%(39/42）。survivin基因在 GADD 45β基因蛋白表達陰性者中的蛋白表達陽性率明顯高于GADD45β陽性表達者(P＜0.05）。 GADD45β基因與survivin基因在 HCC組織中的蛋白表達呈負相關(guān)(r=-0.454,P＜0.05）。見表 3。

表 3 GADD 45β基因和survivin基因在 HCC組織中蛋白表達的相關(guān)性(例）

3 討論

人類 survivin基因定位于染色體 17q25,全長14.7 kb,由 3個內(nèi)含子和 4個外顯子組成,其 mRNA長約 1.9 kb,所編碼的蛋白包含了 142個氨基酸,作為IAP家族中相對分子質(zhì)量最小(僅16 500）的成員,survivin蛋白在結(jié)構(gòu)上具有眾多不同之處,包括氨基端的BIR序列、羧基末端的 α螺旋結(jié)構(gòu)及 BIR序列和 α螺旋結(jié)構(gòu)間的特殊性連接區(qū)域(該區(qū)域具有輸出信號功能而引起 survivin抗凋亡）[5]?；谄洫毺氐姆肿咏Y(jié)構(gòu),survivin可以在抑制細胞凋亡,促進細胞增殖分化,促進新生血管形成及與其他腫瘤相關(guān)因子相互作用等多方面、多途徑促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6]。本結(jié)果顯示,survivin基因在 HCC組織中的蛋白表達陽性率為75.00%,明顯高于正常肝組織的 25.00(P＜0.05）;且病理分化程度低、臨床分期差、門脈內(nèi)癌栓者survivin基因蛋白表達陽性率高(P＜0.05）。這提示 survivin基因與 HCC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

GADD45基因家族是 DNA損傷修復(fù)的重要相關(guān)基因,在細胞凋亡和細胞生存中發(fā)揮作用。GADD45β的 mRNA全長是 1 121 bp,位于 19p13.3,屬于核蛋白。GADD45β基因具有 GADD45基因家族的共有功能,即主要調(diào)節(jié)控制細胞的增生、監(jiān)測細胞周期、誘導(dǎo)細胞凋亡、調(diào)節(jié)控制細胞的負性生長等 DNA損傷修復(fù)途徑相關(guān)的功能[7]。GADD45β主要通過調(diào)控抑癌基因 p53來抑制細胞生長及促進細胞凋亡,GADD45β表達或功能異常導(dǎo)致 p53介導(dǎo)的 DNA損傷修復(fù)途徑異?；蜃钄?不能正確應(yīng)答 DNA損傷、抑制異常細胞的增生、控制細胞周期、促使凋亡的發(fā)生,致使損傷積累,是肝臟細胞惡性轉(zhuǎn)化及形成腫瘤的可能機制[8]。本研究結(jié)果顯示,HCC組織中 GADD45β的蛋白表達陽性率為 38.24%,明顯低于正常肝組織的 85.00%(P＜0.05）,說明 GADD45β基因缺失或蛋白表達異常對 HCC發(fā)生發(fā)展有重要意義;且臨床Ⅲ期 HCC患者GADD45β基因蛋白表達陽性率明顯高于Ⅰ ～Ⅱ期(P＜0.05）,表明 GADD45β能很好的反應(yīng) HCC進展情況及患者預(yù)后。

本組資料還顯示,GADD45β基因與 survivin基因在 HCC組織中的蛋白表達呈負相關(guān),推測可能是在GADD45β基因缺失或不能正常表達的情況下,組織細胞不能正常修復(fù)各種內(nèi)外因素(電離輻射、紫外線、化學(xué)物質(zhì)、病毒感染等）造成的基因損傷或突變致使細胞增殖、分化等生長調(diào)控機制紊亂,細胞出現(xiàn)異型性和惡性增殖,而 survivin基因的異常增加又使細胞的凋亡機制受阻導(dǎo)致機體清除變異細胞的能力下降。GADD45β缺失或不能正常表達與 survivin高表達同時存在的 HCC患者癌細胞增殖侵襲能力強、腫瘤分化差、惡性程度高、術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移概率大,因此聯(lián)合檢測GADD45β基因與 survivin基因的蛋白表達有助于篩選高危患者及判斷預(yù)后。大多數(shù)抗腫瘤藥物都是通過損傷腫瘤細胞 DNA而發(fā)揮作用的,但現(xiàn)階段還沒有化療藥物對 HCC敏感,survivin在 HCC組織中異常高表達為 HCC化療提供了新的靶點,GADD45β在 HCC細胞中特異性缺失或低表達提示我們可通過基因轉(zhuǎn)染或其他可能的方法誘導(dǎo)上調(diào)肝細胞 GADD45β的表達而達到治療 HCC及預(yù)防 HCC發(fā)生的目的。

[1] Ozturk M.Genetic aspects of hepatocellular carcinogenesis[J].Sem in Liver Dis,1999,19(3）:235-242.

[2] 李云峰,錢海利,林晨,等.Gadd45a的表達調(diào)控與功能[J].醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志,2007,4(5）:434-438.

[3] Ambrosini G,Adida C,A ltieri DC.A novelanti-apoptosisgene,survivin,expressed in cancer and lymphoma[J].NatMed,1997,3(8）:917-921.

[4] Ito T,Shiraki K,Sugimoto K,et al.Survivin promotes cell proliferation in human hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,2000,31(5）:1080-1085.

[5] Lens SM,Rodriguez JA,Vader G,et al.Uncoupling the central spindle-associated function of the chromosomal passenger complex from its role at centromeres[J].Mol Biol Cell,2006,17(4）:1897-1909.

[6] Nikolovska-Coleska Z,Meagher JL,Jiang S,et al.Interaction of a cyclic,bivalent smacm imetic with the x-linked inhibitor of apoptosis protein[J].Biochem istry,2008,47(37）:9811-9824.

[7] Qiu W,Zhou B,Zou H,etal.Hypermethylation of growth arrest DNA damage-inducible gene 45 beta promoter in human hepatocellular carcinoma[J].Am JPathol,2004,165(5）:1689-1699.

[8] 邱偉華,Binsen Zhou,Dana Darwish,等.GADD45β基因表達誘導(dǎo)對不同 p53狀態(tài)的肝癌細胞作用[J].外科理論與實踐,2005,10(2）:155-160.

The Expressions and Clinical Significances of Survivin and GADD45βGene in Human Hepatocellular Carcinoma

Zhu Zhijie,Huang Xium ing,Kuang Jisun,Gu Yuan,Dong Xing,Zhao Longshuan
(Department of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery,the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University;

Key Laboratory of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery＆Digestive Organ Transplantation at Henan Universities,Zhengzhou 450052,China）Abstract:Objective To study the expressions and clinical significances of GADD 45βand survivin gene in human hepatocellular carcinoma(HCC）.MethodsImmunohistochem icalmethod was used to detect the expressions ofGADD 45βand survivin in both HCC and normal liver tissues(68 cases of HCC and 20 cases ofnormal liver tissues）.ResultsThe positive rates of GADD45βand survivin expressions in HCC tissues were 38.24%(26/68）and 75.00%(51/68）respectively.The expressions ofGADD 45βand survivin were both closely correlated with the differentiation degree and clinical stage of HCC(P＜0.05）.The expressions of survivin in HCC tissueswere also related to tumor thrombus of portal vein.And the expressions of GADD45βhad negative correlation with the expressions of survivin in HCC tissues(r=-0.454,P＜0.05）.ConclusionGADD45β may inhibit the occurrence and development of HCC,but survivin may have the opposite effect.Combined detection of GADD45βand survivin expressionsmay be beneficial to determine themalignancy degreeand predict prognosis of HCC.

growth arrest DNA damage-inducible gene 45β;survivin;human hepatocellular carcinoma;immunohistochemistry

R 735.7;R 730.23

A

1673-5412(2010）05-0379-03

朱志杰(1985-）,男,在讀碩士,主要從事肝膽胰脾疾病的基礎(chǔ)與臨床研究。E-mail:zhuda1258@126.com

趙龍栓(1964-）,男,教授,主任醫(yī)師,主要從事肝膽胰脾疾病的診治研究。E-mail:zhaoruix@126.com

2010-07-07）