王英婷,黃燮南,王淑蘭

(1.遵義醫(yī)學院藥理教研室,貴州 遵義 563003;2.焦作市五官醫(yī)院,河南 焦作 454150）

紫杉醇聯(lián)合染料木黃酮對人肝癌細胞株 SMMC-7721的作用

王英婷1,2,黃燮南1,王淑蘭2

(1.遵義醫(yī)學院藥理教研室,貴州 遵義 563003;2.焦作市五官醫(yī)院,河南 焦作 454150）

目的利用中效原理體外定量分析紫杉醇及染料木黃酮聯(lián)合應用對人肝癌細胞株SMMC-7721的作用。方法采用MTT法觀察兩種藥物單用及合用對肝癌細胞株SMMC-7721的抑制率,然后用中效方程計算各自的中效濃度,并計算兩種藥物合用時的合用指數(shù)(CI）。結(jié)果兩種藥物單獨使用時隨著藥物劑量的增加,其效應也增加,紫杉醇的中效濃度為 8.912μmol/L,染料木黃酮的中效濃度為 163.680μmol/L。兩種藥物合用時的中效濃度為 58.340μmol/L。大劑量合用(大于中效濃度）時 CI＜1,表示協(xié)同;小劑量合用(小于中效濃度）時CI＞1,表示拮抗。結(jié)論紫杉醇聯(lián)合染料木黃酮對人肝癌細胞株SMMC-7721有抑制作用,兩種藥物大劑量合用時具有協(xié)同作用,小劑量合用時則相互拮抗。

肝癌細胞;紫杉醇;染料木黃酮;中效原理

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細胞株 SMMC-7721由本院微生物教研室提供,然后由本實驗室傳代。主要藥品和試劑:染料木黃酮(Sigma公司）,紫杉醇注射液(上海華聯(lián)制藥有限公司）,RPMI-1640培養(yǎng)基(美國 Gibco公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及藥物濃度設計 人肝癌細胞株SMMC-7721用含體積分數(shù) 10%小牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)基(內(nèi)含質(zhì)量分數(shù) 0.1%青霉素、鏈霉素）培養(yǎng),置于 37℃、體積分數(shù) 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育備用。先將紫杉醇注射液稀釋成 1 g/L的母液,臨用前將該母液用生理鹽水稀釋成實驗濃度 1.315、2.630、5.260、13.170、26.340μmol/L。染料木黃酮用 DMSO配成1 mol/L的母液,于 -20℃保存,臨用時用培養(yǎng)基稀釋,使 DMSO＜0.01%,實驗濃度為 11.25、22.50、45.00、90.00、180.00 μmol/L。

1.2.2 MTT法檢測藥物效應[4]取對數(shù)生長期的SMMC-7721細胞,用培養(yǎng)基調(diào)整細胞的濃度為 5×104個/L的細胞懸液,在 96孔培養(yǎng)板內(nèi)每孔加入 200μL進行培養(yǎng)。實驗設試劑對照組、腫瘤細胞陰性對照組及各種藥物組。將兩種單藥的 5個不同濃度分別加在96孔板內(nèi),每孔加藥量 20μL,每個劑量 3個平行孔,重復 3次。兩種藥物合用比例為 1∶1,每孔加藥總量20μL(每種單藥濃縮 1倍各加 10μL）。在 CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 48 h后,用自動酶標讀數(shù)儀(美國 Bio-Rad-550型,波長 492 nm）測定每孔的 OD值。

1.3 結(jié)果判定 fa=1-(實驗組平均 OD值/對照組平均 OD值）×100%,用自動酶標儀測得的 OD492值進行計算,然后按中效方程 fa/fu=(D/Dm）m計算中效濃度,其中 fa為抑制率,非作用部分 fu=1-fa,D為藥物濃度,m為斜率,Dm為中效濃度(即產(chǎn)生 0.5效應時的藥物濃度）。對中效方程 fa/fu=(D/Dm）m兩邊取對數(shù),logfa/fu=mlogD-mlogDm。設 Y=logfa/fu,X=logD,a=-mlogDm,b=m;代入中效方程 Y=bX-a。根據(jù)該公式計算出兩種藥物單用及合用時各自的中效濃度 Dm(logDm=-a/m）;再計算出單用及兩種藥物合用在各種效應時的合用指數(shù)(combination index,CI）,CI=D1/DX1+D2/DX2+α(D1D2/DX1DX2）,其中可由 fa/fu=(D/Dm）m求得 D=Dm(fa/fu）1/m,D1、D2為兩種藥物合用產(chǎn)生 X效應時兩者各自所需濃度,DX1、DX2為兩種藥物單用產(chǎn)生 X效應時各自的濃度,分別可由 DX=Dm1(X/1-X）1/m1,DX2=Dm2(X/1-X）1/m2求出。α=0為兩種作用機制不同的藥物,α=1為作用機制相同的藥物。CI＜1表示協(xié)同,CI=1表示相加,CI＞1表示拮抗。由于紫杉醇及染料木黃酮為作用機制不同的藥物,故 α=0。

2 結(jié)果

2.1 紫杉醇及染料木黃酮單用及合用時的指數(shù) 兩種藥物單用及合用時,隨著藥物濃度的增加,其效應也增加。根據(jù)上述公式,計算兩種藥物單用及合用時的抑制率 fa,以及不同抑制率 fa時斜率 m、中效濃度 Dm和相關系數(shù) r。以抑制率 fa為橫坐標,CI為縱坐標作量效曲線,進而判斷兩藥在不同效應時各自所需藥物濃度之間相互作用是否為協(xié)同、相加還是拮抗。詳見表 1～3,圖 1。

2.2 染料木黃酮及紫杉醇合用時的中效濃度 紫杉醇及染料木黃酮合用時的中效濃度為58.340μmol/L,當合用效應在 0.500時,CI為 1.00,說明兩種藥物在該效應時的實際濃度分別為 52.210、6.120μmol/L。當合用效應 fa分別為 0.900、0.800、0.700、0.600、0.550、0.500、0.400、0.300、0.200、0.100時,對應的CI分別為 0.443、0.586、0.718、0.852、0.927、1.000、1.197、1.450、1.845、2.730。詳見表 2。

表 1 染料木黃酮及紫杉醇不同濃度單用及合用時的抑制率fa(n=9）

表 2 染料木黃酮及紫杉醇單用及合用時的各種指數(shù)

圖 1 染料木黃酮及紫杉醇合用時的量效曲線

3 討論

紫杉醇是國際上公認的抗瘤效果好、抗瘤譜廣的一線抗腫瘤藥物[5],因其能使微管蛋白和組成微管蛋白的二聚體失去平衡,促進微管蛋白聚合、微管裝配、防止解聚,從而阻止腫瘤細胞的生長。盡管臨床上針對不同腫瘤已形成一系列聯(lián)合化療方案,但仍存在較嚴重的骨髓抑制、神經(jīng)毒性和肌肉毒性[6-7]。因此,尋找能與紫杉醇聯(lián)合應用降低其劑量的藥物具有重大意義。

染料木黃酮為異黃酮類化合物,屬于活性較弱的植物雌激素,廣泛存在于豆科植物中。近年來國內(nèi)外大量研究證實,染料木黃酮具有廣泛的抗腫瘤活性,可抑制多種腫瘤細胞的生長和腫瘤血管的生成,加強多種細胞毒性抗腫瘤藥物的抗腫瘤作用,被認為是頗具前景的抗腫瘤藥和抗腫瘤輔助藥[8]。

本實驗結(jié)果顯示,染料木黃酮與紫杉醇在體外單用時,對 SMMC-7721肝癌細胞均有抑制作用,且有量效關系,其相關系數(shù) r分別為 0.973、0.998。這表明染料木黃酮與紫杉醇對肝癌細胞在體外都有抗增殖作用。

從染料木黃酮及紫杉醇合用時的效應和 CI的關系圖可以看出,兩種藥物在高效應時(大于中效劑量）為協(xié)同作用(CI＜1）,在低效應時(小于中效劑量）為拮抗作用(CI＞1）,在效應為 0.5時,CI=1,說明兩種藥物在該效應劑量時相互作用為增加。而且兩種藥物在合用時的中效濃度均低于單用時的中效濃度。

聯(lián)合用藥是腫瘤化療的基本原則之一,聯(lián)合用藥可以選擇高效應時最小劑量進行,進而減少藥物的毒副反應。染料木黃酮及紫杉醇在體外合用時可以協(xié)同抑制人肝癌細胞株 SMMC-7721的增殖,降低單用時的劑量,從而降低藥物的毒副反應。本研究為兩種藥物聯(lián)合用于肝癌的治療提供了重要線索。

[1] 賈林,李瑜元.染料木黃酮(genistein）對腫瘤的防治作用及其機制[J].廣州醫(yī)藥,2000,31(1）:12-13.

[2] Satoh H,Ishikawa H,Fujimoto M,et al.Angiocytotoxic therapy in human non-small cell lung cancer cell lines--advantage of combined effects of TNP-470 and SN-38[J].Acta Oncol,1998,37(1）:85-90.

[3] Chou TC,Talalay P.Quantitativeanalysisof dose-effect relationships:the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors[J].Adv Enzyme Regul,1984,22:27-55.

[4] 湯為學,駱云鵬,王瑞雪.人實體瘤抗癌藥物敏感試驗 MTT法的建立[J].重慶醫(yī)科大學學報,1992,17(2）:103-108.

[5] 匡燕.紫杉醇的研究進展[J].西南軍醫(yī),2004,6(2）:35-37.

[6] 劉本葉,葉和春,李國鳳.抗癌新藥紫杉醇的研究概況[J].植物學通報,1995,12(3）:8-14,27.

[7] 王海燕,李運曼,劉國卿.紫杉醇抗癌機制研究進展[J].藥學進展,1999,23(4）:209-214.

[8] 孔令泉.染料木黃酮抗腫瘤作用研究進展[J].國外醫(yī)學·腫瘤學分冊,1999,26(5）:285-288.

The Effects of Paclitaxel Combined with Genistein on the Hepatoma-Cellular Strain SMMC-7721

Wang Yingting1,2,Huang Xienan1,Wang Shulan2
(1.Department of Pharmacology,ZunyiMedical College,Zunyi 563003,China;2.Jiaozuo Five Sense Organs Hospital,Jiaozuo 454150,China）

Objective To analyze the effects of paclitaxel and genistein on the hepatoma-cellular strain SMMC-7721 by using median-effect principle,quantitively in vitro.MethodsThe inhibitions of paclitaxel,genistein or paclitaxel combined with genistein on the hepatoma-cellular strain SMMC-7721 weremeasured by MTT assay,and the correspondingmedian effective concentrationswere calculated with medianeffect equation;when the various concentrations of the two drugs used,the combination indexes(CI）were calculated.ResultsThe effects of the individual drugs were increased with a concentration dependentmanner.The median effective concentration of paclitaxel was 8.912 μmol/L and thatof genistein was 163.680μmol/L.However,when the two drugs used in combination,themedian effective concentration was 58.340μmol/L.The CIwas＜1 at thehigher concentration(more thanmedian effective concentration）combination(synergism）,and the CIwas＞1 at the lower concentration(less than median effective concentration）combination(indicating antagonism）.ConclusionThe effects of paclitaxel combined with genistein on hepatoma-cellular strain SMMC-7721 are inhibition,synergistic at the high concentration combination and antagonistic at the lower concentration combination.

hepatoma cell;paclitaxel;genistein;median-effect princip le染料木黃酮是異黃酮類化合物,屬于活性較弱的植物雌激素。近年來大量的流行病學、細胞培養(yǎng)和動物實驗研究證實染料木黃酮對腫瘤具有預防、治療和抑制轉(zhuǎn)移作用[1]。另外,染料木黃酮對環(huán)磷酰胺、表阿霉素、5-Fu等細胞毒藥物具有增效作用[2]。紫杉醇為抗瘤譜較廣的一線抗腫瘤藥,但染料木黃酮與紫杉醇聯(lián)合應用還未見報道,本實驗在體外觀察兩者單用及合用時對人肝癌細胞株 SMMC-7721生長的作用,并根據(jù)中效原理[3]定量分析兩種藥物的相互作用。

R 735.7;R 73-36

A

1673-5412(2010）05-0372-03

王英婷(1971-）,女,碩士,主要從事腫瘤藥理學研究。E-mail:tingwang19@yahoo.com.cn

黃燮南(1943-）,男,教授,主要從事腫瘤藥理學研究。E-mail:huangxienan@yahoo.com.cn

2010-09-06）