武圣江，宋朝鵬，許自成，王松峰，李富強，程傳策，宮長榮*

（1.河南農(nóng)業(yè)大學煙草學院，鄭州 450002；2.農(nóng)業(yè)部煙草類作物質(zhì)量控制重點實驗室，中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所，青島 266101）

由于多種原因，烤煙生產(chǎn)上往往出現(xiàn)上部葉擴展不佳，葉片偏厚，組織結構緊密，在烘烤中調(diào)制不當極易導致光滑煙的現(xiàn)象。而且，近年來的試驗和調(diào)研表明，密集烤房烘烤的煙葉容易出現(xiàn)顏色淺淡、光滑等現(xiàn)象，致使油分不足，工業(yè)企業(yè)的反響尤為突出[1]。為切實解決這一問題，我國在提高上部葉可用性方面進行了較多的研究[2]。紀成燦等[3]認為，提高采收成熟度，延長40～45℃烘烤時間可顯著降低光滑煙比例。另外，有人通過對光滑煙葉外觀分選、化學品質(zhì)分析、單料煙評吸，提出光滑類煙葉合理分組定級的原則[4-5]。但目前在密集烘烤中從細胞生理生化變化上探討上部光滑葉的形成機理尚不多見。本試驗通過研究上部葉烘烤中細胞水解酶及主要組分變化規(guī)律，探討光滑煙葉形成的生理機制，為進一步提高上部葉的可用性和優(yōu)化密集烘烤工藝提供新的依據(jù)和思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于 2007―2008年在河南省伊川縣白元鄉(xiāng)王耆店村進行，供試品種為煙草(Nicotiana tabacumL)新NC89，5月上旬移栽，種植行距120 cm，株距 50 cm。土壤堿解氮 49.52 mg/kg，速效磷 6.8 mg/kg，速效鉀145.31 mg/kg，pH為8.49。施純氮45.0 kg/hm2，m(N):m(P2O5):m(K2O)=1:2:3。規(guī)范化栽培管理，以上部葉(第16～18葉位)為試驗材料，依據(jù)成熟標準，煙葉成熟時按照葉位單葉采收。

1.2 樣品制備

采用河南農(nóng)業(yè)大學設計的電熱式溫濕自控密集烤煙箱烘烤，烘烤時裝煙密度為70 kg/m3，按照三段式烘烤工藝進行烘烤。分別在煙葉烘烤的關鍵溫度點取樣兩份(烤前鮮樣；干球38℃，濕球35℃左右，煙葉變黃八成發(fā)軟；干球 42℃，濕球 36～37℃，煙葉黃片青筋主脈發(fā)軟；干球 48℃，濕球38℃左右，黃片黃筋小卷筒；干球54℃，濕球39℃左右，葉片全干大卷筒；烤后樣)，切去葉尖和葉基部，留葉中部分。一份用于生理生化指標的測定。另一份于烘箱中105℃下殺青5 min，在60℃下烘干、粉碎，過 60目篩，用于細胞壁成分的測定。各重復3次。

1.3 測定項目及方法

煙葉細胞壁降解酶的提取液配制和纖維素酶活性的測定，參照Andrews和Li[6]的方法。煙葉水分含量的測定，果膠甲酯酶(pectin methylesterase，PME)活性和纖維素含量的測定，采用寧正祥[7]的方法。多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase，PG)活性和果膠物質(zhì)含量測定，采用韓雅珊[8]的方法。

2 結 果

2.1 烘烤中細胞壁水解酶活性的變化

2.1.1 烘烤中煙葉細胞壁 PME酶活性變化 PME的作用是水解果膠分子中甲酯化的羧基，使果膠中高度甲酯化的糖醛酸殘基生成多聚半乳糖醛酸和甲醇，同時為PG的活動提供了條件[9]。從圖1可以看出，烘烤中PME酶活性在38～48℃之間較高，尤其在42℃酶活性達到峰值，為34.61 U/kg(FW)。38～48℃之間較高的 PME活性能夠破壞細胞結構的完整性，使細胞內(nèi)大分子物質(zhì)充分降解和轉化，不利于光滑煙的形成。水分含量在38～48℃之間損失約為32%，是水分損失較多的一個階段。

圖1 烘烤中PME活性的變化Fig.1 Changes of activity of pectin methylesterase during flue-curing process

2.1.2 烘烤中煙葉細胞壁PG酶活性的變化 PG是主要的果膠水解酶之一，能夠水解植物細胞壁及胞間層的果膠物質(zhì)[10]。從圖2可以看出，PG酶活性38℃后顯著升高，在42～54℃之間一直保持較高的酶活性，并在48℃達到峰值，為946.07 U/kg (FW)。相關性分析表明，PG與水分含量呈顯著負相關，相關系數(shù)為-0.951*，表明較高的PG活性可加速細胞壁的分解和煙葉水分的排出；PG與溫度顯著正相關，相關系數(shù)為0.901*，表明PG活性受溫度抑制的影響較小(表1)。

圖2 烘烤中PG酶活性的變化Fig.2 Changes of activity of polygalacturonase during flue-curing process

2.1.3 烘烤中煙葉細胞壁纖維素酶活性變化 一般纖維素酶的最適溫度范圍為40～60℃，其活性的表達與細胞壁的降解密切相關[11]。從圖3可以看出，纖維素酶在38～48℃之間酶活性較高，尤其在42℃達到峰值，為183.29 U/g(FW)。纖維素的分解破壞了煙葉細胞的骨架結構，使細胞內(nèi)含物互相融合，獨立區(qū)域被打破，從而發(fā)生復雜的生理生化變化，有利于內(nèi)部物質(zhì)的充分降解和轉化。相關性分析表明，纖維素酶與PME的相關系數(shù)達到0.979**，呈極顯著正相關(表1)。

圖3 中纖維素酶活性的變化Fig.3 Changes of activity of cellulase during flue-curing

2.2 烘烤中細胞壁主要組分含量的變化

2.2.1 烘烤中煙葉細胞壁果膠物質(zhì)的變化 果膠是細胞壁中膠層的主要組分，煙葉果膠質(zhì)含量集中在5%～9%之間[12]。從圖4可以看出，在變黃期和定色前期有大量的可溶性果膠生成，相反，原果膠含量逐漸下降；總果膠含量在整個烘烤中有逐漸下降的趨勢。可溶性果膠的生成在38℃以前增加最明顯；原果膠在 38℃以前和 42～48℃之間有明顯的降低；總果膠在48～54℃之間降低最明顯。相關性分析表明，原果膠與煙葉水分含量呈顯著正相關，相關系數(shù)為0.909*；原果膠與可溶性果膠呈極顯著負相關，相關系數(shù)為-0.936**；原果膠與PG顯著負相關，相關系數(shù)為-0.950*(表1)。

圖4 烘烤中果膠質(zhì)含量的變化Fig.4 Changes of pectin contents during flue-curing

2.2.2 烘烤中煙葉細胞壁纖維素的變化 纖維素是構成煙葉細胞組織和骨架的基本物質(zhì)，煙葉中全纖維素含量集中在15%～25%之間，它隨著煙葉等級的下降而增加[12]。從圖5可以看出，纖維素含量在烘烤過程中呈逐漸下降的趨勢。纖維素含量在38～48℃之間明顯降低，尤其在42～48℃之間降低更加明顯，48℃后變化不是很大。相關性分析表明，纖維素與水分含量的相關系數(shù)為0.944**，呈極顯著正相關；纖維素與原果膠、總果膠的相關系數(shù)分別為 0.909*和 0.953**(表1)。

圖5 烘烤中纖維素的變化Fig.5 Changesof cellulose contents during flue-curing

表1 烘烤中煙葉細胞壁酶、組分、水分含量及溫度之間的相關性Table1 Correlation among cell wall enzymes, components, water content of tobacco leaves and temperature during flue-curing

2.3 烘烤中煙葉細胞壁酶、組分、水分含量及溫度之間的相關性分析

煙葉細胞壁酶活性不僅受水分含量的影響，同時還受溫度等因素的影響。由表1可知，溫度與PG酶活性呈顯著正相關；與纖維素、原果膠、水分含量呈顯著負相關(P＜0.05)。煙葉的水分含量與PG酶活性呈顯著負相關，與原果膠呈顯著正相關(P＜0.05)；同時與纖維素的負相關性達到極顯著水平(P＜0.01)。

在煙葉內(nèi)部 PME與纖維素酶的相關性也達到極顯著水平(P＜0.01)。在細胞壁成分中原果膠與可溶性果膠呈極顯著負相關(P＜0.01)。而且，原果膠、總果膠與纖維素呈顯著正相關(P＜0.05)。PG酶活性變化與可溶性果膠的相關系數(shù)為 0.865，但不顯著(P＞0.05)；與原果膠達到顯著負相關水平，相關系數(shù)為-0.950*。但 PME與可溶性果膠、原果膠、總果膠的相關系數(shù)均小于0.6。

3 討 論

PME[9]、PG[10]及纖維素酶[11]在細胞壁降解中起著重要的作用，較高的酶活性能加速果膠的水解和促進細胞生化反應，進而為防止光滑煙的形成提供了條件。本試驗結果表明，PME在 42℃酶活性達到最大值，它不僅參與了煙葉細胞壁的降解代謝，而且和煙葉軟化進程及光滑煙的形成有關。酶促棕色化反應發(fā)生的關鍵溫度為45～50℃[13]，而PG最高酶活性在48℃。PG酶活性的變化將會對煙葉棕色化反應和外觀質(zhì)量產(chǎn)生很大的影響，并且可能與密集烤房烤后煙葉顏色淡有關。纖維素酶活性在42℃達到最大值，較高的纖維素酶活性有利于破壞細胞內(nèi)部結構的完整性，加速煙葉內(nèi)部生理生化反應的發(fā)生，促進細胞內(nèi)物質(zhì)的降解和轉化。相關性分析表明，纖維素酶與 PME呈極顯著正相關，表明二者在細胞壁物質(zhì)降解中密切相關。

細胞壁物質(zhì)含量高，其煙氣具有強烈的刺激性、嗆咳、澀口且枯焦氣和木質(zhì)氣重，影響煙葉吃味；適當降低煙葉細胞壁物質(zhì)含量，則能提高煙葉質(zhì)量。試驗結果表明，在密集烘烤中可溶性果膠不斷生成，原果膠、總果膠和纖維素含量不斷降低。變黃期和定色中前期是果膠、纖維素含量變化最劇烈的階段，也是煙葉物質(zhì)含量損失最多的時期[13]。相關性分析表明，PG與原果膠呈顯著負相關，但PME與原果膠的相關性不顯著。而且，PG和總果膠和可溶性果膠的系數(shù)均大于與 PME的，這表明果膠(總果膠、原果膠及可溶性果膠)與 PG 的關系比果膠與PME的關系更密切，即PG更有利于水解細胞壁和抑制光滑葉的形成。

煙葉在密集烘烤中變黃、失水、塌架、衰老是由細胞壁物質(zhì)不斷降解引起的[14]。并且，細胞壁物質(zhì)的降解進程與光滑煙的形成密切相關。烘烤中光滑煙的形成導致煙葉的品質(zhì)和可用性降低，究其原因可能是細胞壁酶活性受到限制，煙葉水分不適，細胞壁物質(zhì)水解不完全或很少，內(nèi)含物降解和轉化不充分，進而導致光滑煙的形成[3]。

通過試驗我們發(fā)現(xiàn)，密集烘烤中煙葉酶促反應和煙葉衰老、脫水干燥進程是緊密相連的。細胞壁物質(zhì)的降解及光滑煙的形成并不僅僅是細胞壁酶作用的結果，還與細胞壁內(nèi)酶的協(xié)同作用及各種成分的轉化有關。另外，目前對密集烤房與普通烤房煙葉烘烤細胞生理變化差異還缺少對比性的研究，并且尚不清楚細胞壁酶活性變化對密集烘烤中和烤后煙葉各種常規(guī)化學成分的影響，尤其對香氣物質(zhì)的影響，詳細的作用機理還有待進一步探討。

4 結 論

烘烤中可溶性果膠含量不斷增加，原果膠、總果膠和纖維素含量不斷降低，其中果膠(總果膠、原果膠及可溶性果膠)與PG的關系比果膠與PME的關系更密切，即PG更有利于水解細胞壁和抑制光滑葉的形成。根據(jù)細胞壁酶活性及組分在密集烘烤中的變化規(guī)律，分別在 38～48℃，尤其是在 42℃適當延長烘烤時間，創(chuàng)造適宜的環(huán)境條件，保持較高的細胞壁酶活性，促使酶降解細胞壁物質(zhì)及內(nèi)部大分子物質(zhì)充分轉化，這不僅有利于降低細胞壁組分和抑制定色后期棕色化反應的發(fā)生，同時也有利于細胞內(nèi)各種生理生化反應的充分發(fā)生，防止光滑葉的形成，確保煙葉生產(chǎn)的質(zhì)量和效益。

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