陳小霞,岳振峰,葉衛(wèi)翔,趙鳳娟,饒麗,葛麗雅,歐陽(yáng)姍

1(深圳大學(xué)教務(wù)處,廣東深圳,518060) 2(深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,廣東深圳,518067)

維吉霉素 (Virginiamycin),別名維吉尼亞霉素、維吉尼霉素、肥大霉素等。維吉霉素是美國(guó)史克藥廠畜禽保健公司對(duì)鏈球菌發(fā)酵提取的抗生素。它由70%大環(huán)內(nèi)酯 (M1)(圖 1)和 30%環(huán)狀多肽 (S1)(圖2)混合組成。兩者結(jié)構(gòu)不同,抗菌范圍也不同。維吉霉素的作用主要是抑制細(xì)菌的核糖體(Ribosome),從而阻止細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成而達(dá)到殺菌效果。維吉霉素可用于防治畜禽細(xì)菌性痢疾和雞壞死性腸炎,改善飼料的利用率,促進(jìn)畜禽的生長(zhǎng),已被廣泛使用。但這類(lèi)藥物也存在一定的副作用,存在著潛在的食品安全風(fēng)險(xiǎn)。中國(guó)、美國(guó)、日本均規(guī)定了動(dòng)物組織中維吉霉素的最高殘留限量,其中以日本的限量規(guī)定最為全面和嚴(yán)格;歐盟則禁止維吉霉素作為飼料添加藥物使用。維吉霉素在動(dòng)物組織中主要以原形藥物狀態(tài)存在。目前各國(guó)法規(guī)中沒(méi)有明確規(guī)定維吉霉素的殘留標(biāo)識(shí)物,但由于 M1為主要成分,國(guó)內(nèi)外普遍將維吉霉素M1作為維吉霉素的殘留標(biāo)識(shí)物。

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于動(dòng)物源性食品中維吉霉素藥物殘留的檢測(cè)方法研究報(bào)道均較少[1-13],方法包括瓊脂擴(kuò)散法[1]、酶聯(lián)免疫法[2]、薄層色譜法與生物自顯影聯(lián)用法[3-4]、高效液相色譜法[5-10]和液質(zhì)聯(lián)用法[11-13],其中 GB/T 20765—2006規(guī)定了豬肝臟、腎臟、肌肉組織中維吉尼霉素M1殘留量的測(cè)定方法,但該方法的線性范圍未包括國(guó)內(nèi)外的限量規(guī)定濃度,而且需要繁瑣的固相萃取步驟,效率低下。本文采用乙腈脫蛋白同時(shí)提取目標(biāo)物,水稀釋,再利用液質(zhì)聯(lián)用法的選擇性較高和抗干擾能力較強(qiáng)的特點(diǎn),實(shí)現(xiàn)了動(dòng)物組織樣品中維吉霉素殘留的快速測(cè)定和確證。

圖 1 維吉霉素M1的分子結(jié)構(gòu)

圖 2 維吉霉素 S1的分子結(jié)構(gòu)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

API3000型三級(jí)四極桿質(zhì)譜儀 (美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司),配電噴霧離子源和 Agilent 1100型液相色譜儀;MinishakerMS1型漩渦混合器 (美國(guó) IKA公司);PT3000型均質(zhì)器 (德國(guó) Brinkmann公司);Turbo LV型吹氮濃縮儀 (美國(guó) Zymark公司);Universal 32型低溫離心機(jī) (德國(guó) Hettich公司);KQ-50B型超聲清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)等。

維吉霉素M1(Sigma公司,純度約 95%);乙腈和甲酸均為色譜純?cè)噭?其他均為分析純?cè)噭?水為超純水。

雞肉、雞肝、雞腎、豬腎和牛腎等動(dòng)物組織樣品均為市購(gòu)。

1.2 樣品處理

稱(chēng)取試樣 1 g(精確到 0.01 g),置于 15 mL具塞聚丙烯離心管中,加入 3 mL乙腈,旋渦混合 1 min,冰水浴超聲提取 5min。以 3 000 r/min的轉(zhuǎn)速在 15℃下離心 5 min,收集上清液于具有刻度的離心管中。離心后的殘?jiān)?2 mL乙腈重復(fù)上述提取步驟 1次,合并上清液,用水稀釋定容至 10mL,混勻。加入 4mL正己烷,混合 1min,3 000 r/min 5-15℃離心 5 min,棄去正己烷層,下層溶液過(guò) 0.22 μm濾膜后供液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.3 色譜質(zhì)譜條件

Y MC-Pack Pro C18色譜柱 (3μm,100 mm ×2.0 mm i.d.);流速:0.3 mL/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:10 μL。流動(dòng)相為乙腈和 0.003 mol/L甲酸銨緩沖液,洗脫梯度:乙腈的比例在 1.0min內(nèi)由 30%線性提高到70%,保持 4.0min,柱平衡時(shí)間 5 min。

ESI+離子化模式;質(zhì)譜分辨率:單位質(zhì)量分辨率;監(jiān)測(cè)模式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè) (MRM);霧化氣:5.0 L/min;氣簾氣:12.0 L/min;噴霧電壓:4.5 kV;去簇電壓 (DP):50 V;聚焦電壓 (FP):270 V;射人電壓(EP):10 V;去溶劑溫度:550℃;去溶劑氣流:7.0 L/min;碰撞氣 N2:6.0 L/min。其他條件見(jiàn)表 1。

表 1 維吉霉素M1的保留時(shí)間和優(yōu)化質(zhì)譜條件(帶“＊”號(hào)者為定量離子)

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

首先采用 10 mg/L的待測(cè)化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液以流動(dòng)注射的方式在正離子模式下進(jìn)行全掃描,確定分子離子,然后以待測(cè)化合物的分子離子為母離子,進(jìn)行子離子掃描。選取豐度較強(qiáng)、干擾較小的 2個(gè)子離子為定性離子。最后以多反應(yīng)監(jiān)測(cè) (MRM)正離子模式優(yōu)化去簇電壓 (DP)、聚焦電壓 (FP)、射人電壓(EP)、碰撞能量 (CE)、碰撞室射出電壓 (CXP)、霧化氣 (NEB)、氣簾氣 (CUR)、碰撞氣 (CAD)、噴霧電壓(IS)、離子化溫度 (TEM)等各種質(zhì)譜參數(shù),得到最佳質(zhì)譜條件 (表 1)。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

因維吉霉素M1分子結(jié)構(gòu)中有多個(gè)氨基和羥基,能在水中發(fā)生解離,色譜柱固定相表面的殘存硅醇基和金屬離子可通過(guò)氫鍵或離子交換作用對(duì)其產(chǎn)生強(qiáng)烈吸附作用,出現(xiàn)色譜峰拖尾、保留時(shí)間不穩(wěn)定或過(guò)長(zhǎng),甚至被保留在色譜柱上,導(dǎo)致峰形異常和分離度下降。本研究采用以高純硅膠為基體并經(jīng)端基封閉處理的 Y MC-Pack Pro C18柱進(jìn)行了分離試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)該柱對(duì)維吉霉素和干擾成分具有良好的分離效果和對(duì)稱(chēng)的峰形,可滿足質(zhì)譜檢測(cè)的要求。

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) G B/T 20765—2006采用甲醇 +乙腈 (50+50)與 0.003mol/L甲酸銨緩沖液作為流動(dòng)相,需要 35 min才能完成檢測(cè)。本方法用乙腈代替甲醇 +乙腈(50+50),通過(guò)梯度優(yōu)化,可將檢測(cè)時(shí)間縮短到 10min,大幅提高了檢測(cè)效率,而且峰形尖銳對(duì)稱(chēng) (圖 3)。

圖 3 加標(biāo)雞肉樣品中維吉霉素M1的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖 (加標(biāo)濃度 25μg/kg)

2.3 提取和凈化條件的選擇

文獻(xiàn)報(bào)道的提取溶劑主要有:甲醇 +磷酸氫二銨[5]、甲醇[6]、甲醇 +乙腈[7,12]、乙酸乙酯[9,11]、乙腈[13]等,本方法經(jīng)比較試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),直接采用乙腈超聲提取不僅可以減少脂肪等雜質(zhì)的提出,而且回收率較高。文獻(xiàn)報(bào)道的凈化方法包括 C18固相萃取凈化[1-3]、硅膠 +HLB固相萃取凈化[4]等。本文經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),樣品提取液經(jīng)水稀釋后用正己烷凈化,即可達(dá)到凈化要求,不僅避免了煩瑣的固相萃取凈化步驟,而且降低了檢測(cè)成本,提高了檢測(cè)效率。

2.4 樣品基質(zhì)效應(yīng)的考察

大氣壓噴霧電離離子源 (ESI)容易受樣品基質(zhì)的影響,但通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液與純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值不存在顯著差異,因此維吉霉素M1不存在樣品基質(zhì)效應(yīng)或樣品基質(zhì)效應(yīng)不顯著。

2.5 方法的線性關(guān)系和定量低限

在本檢驗(yàn)方法所確定的實(shí)驗(yàn)條件下,取一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,以峰面積 (Y軸)對(duì)相應(yīng)的維吉霉素M1的濃度 (X軸)作圖,結(jié)果表明,標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度與對(duì)應(yīng)的峰面積在 2-50μg/L內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,線性方程為Y=2.96×103x+2.27×103,線性相關(guān)系數(shù)為0.999 5。經(jīng)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)驗(yàn)證試驗(yàn),確定本方法的定量低限為:雞肉 25μg/kg、雞肝 100μg/kg、雞腎 100μg/kg、牛腎 100μg/kg、豬腎150μg/kg。

2.6 方法的回收率與精密度

以不含維吉霉素M1殘留的動(dòng)物組織為空白樣品基質(zhì),綜合考慮中國(guó)、美國(guó)、日本以及中國(guó)香港的最大殘留限量規(guī)定,按照表 2進(jìn)行 3個(gè)濃度水平進(jìn)行添加回收試驗(yàn),每個(gè)濃度水平進(jìn)行 10次重復(fù)試驗(yàn),測(cè)得維吉霉素的回收率和精密度匯總于表 3。本方法的回收率范圍為:雞肉 86.8%-108%、雞肝 81.8%-109%、雞腎 85.5%-102%、豬腎 82.7%-102%、牛腎 80.7%-103%,實(shí)驗(yàn)室內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為:雞肉4.3% -6.7%、雞肝 3.3%-7.3%、雞腎 2.8%-4.6%、豬腎 1.9%-4.1%、牛腎 3.4%-6.9%,符合國(guó)內(nèi)外對(duì)殘留分析的要求。

表 2 不同樣品基質(zhì)中維吉霉素M1的添加水平 μg/kg

2.7 實(shí)際樣品分析

應(yīng)用本方法分別檢測(cè)雞肉、雞肝、雞腎、豬腎和牛腎樣品各 20批,檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)情況匯總于表 4?？梢?jiàn),除豬腎和雞肉樣品各檢出 1例不合格樣品外,其他樣品均合格。該方法具有靈敏高、選擇性強(qiáng)、簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn),方法的各項(xiàng)性能指標(biāo)滿足國(guó)內(nèi)外食品安全法規(guī)的要求,可用于動(dòng)物組織樣品中維吉霉素M1殘留的快速確證檢測(cè)。

表 4 動(dòng)物組織樣品中維吉霉素M1殘留的實(shí)際樣品檢測(cè)情況匯總表

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