楊希

(1.福建省林業(yè)科學(xué)研究院,福建福州 350012;2.國(guó)家林業(yè)局南方山地用材林培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建福州 350012)

福建省松枯死木檢測(cè)鑒定方法與結(jié)果分析

楊希1,2

(1.福建省林業(yè)科學(xué)研究院,福建福州 350012;2.國(guó)家林業(yè)局南方山地用材林培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建福州 350012)

采用常規(guī)檢測(cè)法 (貝爾曼漏斗法)研究了松枯死木中的線蟲種類、相互存在關(guān)系和檢出情況。初步將線蟲分為 4大類:松材線蟲、擬松材線蟲、傘滑刃屬其它線蟲和非傘滑刃屬線蟲。其在枯死木中的存在關(guān)系有14種類型。(1)松材線蟲;(2)松材線蟲、擬松材線蟲和非傘滑刃屬線蟲;(3)松材線蟲和傘滑刃屬其它線蟲;(4)松材線蟲和非傘滑刃屬線蟲;(5)松材線蟲、傘滑刃屬其它線蟲和非傘滑刃屬線蟲;(6)松材線蟲、擬松材線蟲、傘滑刃屬其它線蟲和非傘滑刃屬線蟲;(7)擬松材線蟲;(8)擬松材線蟲和傘滑刃屬其它線蟲;(9)擬松材線蟲和非傘滑刃屬線蟲;(10)擬松材線蟲、傘滑刃屬其它線蟲和非傘滑刃屬線蟲;(11)傘滑刃屬其它線蟲;(12)傘滑刃屬其它線蟲和非傘滑刃屬線蟲;(13)非傘滑刃屬線蟲;(14)無線蟲。2008～2010年,松材線蟲檢出率分別為 34.59%、28.21%和 24.19%,呈逐年下降趨勢(shì);擬松材線蟲檢出率為 14.04%、16.03%和 0.8%。每年松材線蟲檢出率與季節(jié)的關(guān)系差異不明顯,但常年基本上都有松材線蟲,為枯死木的取樣增加了難度。應(yīng)用指示劑 1號(hào)進(jìn)行快速檢測(cè),結(jié)果表明,對(duì)于松材線蟲病木,其準(zhǔn)確率達(dá) 100%。隨著時(shí)間流失,松材線蟲在枯死木中慢慢消失,影響常規(guī)檢測(cè)和快速檢測(cè)結(jié)果,所以盡量在松樹枯死初期取樣。

松枯死木;檢測(cè)鑒定方法;線蟲;快速檢測(cè);福建

松材線蟲病也稱松樹萎蔫病,是一種由松材線蟲 (B ursaphelenchus xylophilusSteiner et Buhrer)引起,危害松樹的毀滅性病害[1-5]。近幾年,課題組對(duì)全省各地采集的松樹枯死木樣本,在檢測(cè)鑒定是否為松材線蟲所致的同時(shí),探討了松樹枯死木中線蟲種類、相互存在關(guān)系 (未見報(bào)道)和檢出情況。同時(shí),對(duì)部分松枯死木樣本進(jìn)行了快速檢測(cè)研究,可為我省各地在松材線蟲病監(jiān)測(cè)時(shí)的取樣、檢測(cè)鑒定提供參考。

1 材料

1.1 試材來源

取自福建省內(nèi)馬尾松枯死木木段、圓盤、木塊等,樹齡 5～30a,胸徑 2.8～52cm。指示劑 1號(hào)由國(guó)家林業(yè)局森林病蟲害防治總站的王玉嬿老師提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

砍刀、枝剪,漏斗架、漏斗 (外口徑 90～120mm)100個(gè),試管架,口徑 15～20cm塑料盤 30個(gè),口徑 10cm、高 6～10cm塑料杯 100個(gè) (裝樣用),15 mm ×100 mm指形管 200個(gè),25mm ×200mm大試管 30個(gè),吸管 50個(gè),載 (蓋)玻片各 2盒,鑷子,雙層紙巾,雙鏡頭電子顯微鏡,水浴鍋,酒精燈,酒精,指示劑 1號(hào)等。

2 檢測(cè)、鑒定方法

2.1 常規(guī)檢測(cè)法

即貝爾曼漏斗法,線蟲具有趨水性,游離于水中,由于重力作用沉淀下來。

2.1.1 取樣 松材線蟲的種群數(shù)量在罹病木中處于動(dòng)態(tài)變化之中[6-7]。取樣工作有一定的難度,要定期進(jìn)行林間調(diào)查,發(fā)現(xiàn)疑是松材線蟲病木,及時(shí)在發(fā)病初期,在樹干的上 (盡量靠近第一枝分叉處)、中、下 (高出土層 20cm)分別取樣。樣本取下后單獨(dú)包裝,以免互相感染。記錄樣本編號(hào)、取樣時(shí)間、地點(diǎn)、樹種、樹高、胸徑、樹齡、取樣部位及有無松墨天牛和其它病蟲危害,對(duì)樣本進(jìn)行及時(shí)的檢測(cè)。未能及時(shí)檢測(cè)的,取樣時(shí)應(yīng)相對(duì)大一點(diǎn),以防樣本失水而導(dǎo)致線蟲死亡,影響檢測(cè)鑒定結(jié)果。

2.1.2 樣品制作 為了檢測(cè)鑒定結(jié)果更加準(zhǔn)確,盡量將樣本剪切碎,以便裝滿漏斗,提高線蟲量。根據(jù)漏斗的大小,樣品重 10～100g。制作每份樣品之間要將木塊、碎屑清理干凈。對(duì)于較干燥的樣本,如包裝板等,應(yīng)增加樣品的量。

2.1.3 分離線蟲 先將清水慢慢注入漏斗中,并檢查是否漏水,擠掉漏斗頸中的氣泡。用適當(dāng)大小的兩層紙巾鋪于漏斗中,將劈好的樣品放在上面,輕輕將紙巾四周折到樣品上,再注入水漫過紙包。夏季浸泡 4～12 h左右,冬季浸泡 12～24 h左右 (溫度較低時(shí),用 35～40℃的溫水分離;或提高室內(nèi)溫度)。當(dāng)線蟲從樣品中逸出并沉于橡皮管底部,慢慢打開彈簧止水夾,沉于底部的線蟲順?biāo)魅胫感喂?收集線蟲液 2～8ml。線蟲量較多時(shí),用肉眼能看到,即可顯微鏡鏡檢;線蟲較少的,離心 (3000r/min)2～3 min或沉淀 2～4h(放置時(shí)間長(zhǎng)短視線蟲量而定),吸去上層清液,再鏡檢。

2.1.4 線蟲鑒定及分類 植物線蟲的分類主要是根據(jù)其外部形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的特征。本研究線蟲鑒定的方法參照楊寶君等編著的《松材線蟲病》[1]。

2.2 快速檢測(cè)法

2.2.1 試驗(yàn)依據(jù) 木材中含有微量的堿金屬和堿土金屬,它們與木材中的有機(jī)酸形成相應(yīng)的鹽類[8],因此木材的水浸提液具有一定的緩沖性能,木材在一定程度上具有保持本身 pH值不改變的性能。相亞明在對(duì)國(guó)產(chǎn) 25種木材水浸提液的 pH值和緩沖容量的研究中,測(cè)得 8種針葉樹材 pH值在 4.34～5.14范圍內(nèi)[7]。松材線蟲病材的 pH值降低,可選適當(dāng)?shù)闹甘緞┩ㄟ^顯色反應(yīng)加以區(qū)分松材線蟲病材與健材;通過采用被檢木鉆木屑的有機(jī)溶劑提取液進(jìn)行顏色反應(yīng)來區(qū)分松材線蟲病、健木,利用指示劑 l號(hào)進(jìn)行快速檢驗(yàn)檢疫,對(duì)馬尾松的準(zhǔn)確率為89%[9-10]。

2.2.2 樣品的制備 靠近樹皮的木質(zhì)部連同樹皮一起去掉,在靠近枯死木樣本中間的、相對(duì)干凈的部分取樣。為節(jié)約成本,減少酒精的用量,盡量將樣本剪切碎。本試驗(yàn)將樣本制成長(zhǎng)、寬、高均≤5mm的小粒,每份樣品 5g,分別標(biāo)記裝入 25mm×200mm大試管中,選取棉塞將管口塞緊備用,以防在煮沸過程中酒精揮發(fā)掉,影響檢測(cè)結(jié)果。

往各大試管中倒入 70%～80%的乙醇 ,約為樣品高度的 1.5～2倍 ,并將管口塞緊。盡快將試管置于 80℃～90℃的水浴鍋中,10min后取出置于冰水中冷卻后備用 (樣品超出 20個(gè)可適當(dāng)延長(zhǎng) 1～2min)。本試驗(yàn)所用的水浴鍋為江蘇金壇市江南儀器廠制造的 HH-2型雙孔恒溫水浴鍋,一次可放 30個(gè)試管。

2.2.3 松材線蟲病、健木的顏色反應(yīng) 取若干個(gè) 15mm×100mm的指形管,并對(duì)應(yīng)編號(hào)。將大試管中冷卻的上清液謹(jǐn)慎倒入相應(yīng)的指形管中 2～3 mL(或用吸管吸取,1個(gè)吸管對(duì)應(yīng) 1個(gè)樣品)備用。在每個(gè)指形管中滴入 1滴事先準(zhǔn)備好的指示劑,搖勻,觀察記錄指形管中液體顏色的變化。

3 結(jié)果與分析

3.1 枯死木中線蟲的種類

松材線蟲可引起松樹的毀滅性災(zāi)害[1];擬松材線蟲對(duì)松苗和衰弱樹有一定的致病性[11-12];松樹中的其它線蟲有無致病性,目前尚未見報(bào)道。所以,本研究以松材線蟲和擬松材線蟲為主。根據(jù) 2008～2010年對(duì)松枯死木中 (不含樹皮)的線蟲的檢測(cè)鑒定結(jié)果,初步將其分為 4大類:松材線蟲、擬松材線蟲、傘滑刃屬其它線蟲和非傘滑刃屬線蟲 (有待鑒定)。對(duì)每個(gè)樣本中的線蟲種類進(jìn)行統(tǒng)計(jì) (圖 1),出現(xiàn) 14種類型。⑴只有松材線蟲;⑵松材線蟲、擬松材線蟲和非傘滑刃屬線蟲混生;⑶松材線蟲和傘滑刃屬其它線蟲混生;⑷松材線蟲和非傘滑刃屬線蟲混生;⑸松材線蟲、傘滑刃屬其它線蟲和非傘滑刃屬線蟲混生;⑹松材線蟲、擬松材線蟲、傘滑刃屬其它線蟲和非傘滑刃屬線蟲混生;⑺只有擬松材線蟲;⑻擬松材線蟲和傘滑刃屬其它線蟲混生;⑼擬松材線蟲和非傘滑刃屬線蟲混生;⑽擬松材線蟲、傘滑刃屬其它線蟲和非傘滑刃屬線蟲混生;⑾傘滑刃屬其它線蟲;⑿傘滑刃屬其它線蟲和非傘滑刃屬線蟲混生;⒀非傘滑刃屬線蟲;⒁無線蟲。2008～2009年,以非傘滑刃屬線蟲的檢出率較高,為 31.08%和 22.765;2010年,以傘滑刃屬其它線蟲和非傘滑刃屬線蟲混生的類型檢出率較高,為 39.68%。三年來,純松材線蟲檢出率偏低,為 4.59%～5.95%。表明松樹在遭到松材線蟲侵染后期,由于其它線蟲的大量繁殖,占據(jù)種群優(yōu)勢(shì)。松材線蟲和擬松材線蟲共存的現(xiàn)象比較少見,即⑵和⑹兩種類型,三年來其最高檢出率僅為 0.27%。2008～2010年,松材線蟲⑴～⑹類型的檢出率分別為 34.59%、28.21%和 24.19%,呈逐年下降趨勢(shì)。

圖 1 2008～2010年松枯死木中線蟲類型分布

除去松材線蟲樣本,三年來,擬松材線蟲⑺～⑽的檢出率為 13.77%、16.05%、0.8%。據(jù)湯勤[11]等報(bào)道,用擬松材線蟲接種重慶南山馬尾松 ,對(duì)健康樹無致病性,而對(duì)衰弱樹的平均致死率為 5.88%。張治宇等[12]的研究表明:黑松苗在感染擬松材線蟲后,用自然界水分脅迫和 PEG脅迫處理,能明顯加快黑松苗死亡速度,且大大提高死亡率。關(guān)于我省擬松材線蟲的致病性,有待進(jìn)一步的研究。

傘滑刃屬其它線蟲和非傘滑刃屬線蟲⑾～⒀類型的檢出率分別為 50.93%、47.01%和52.37%,目前,有關(guān)的研究少見報(bào)道。無線蟲檢出率分別為 5.94%、8.68%和 22.62%,呈逐年增加。

3.2 2008年松枯死木中線蟲分布

由于枯死木中的線蟲種類不止 1種,在統(tǒng)計(jì)的時(shí)候會(huì)出現(xiàn)重復(fù)計(jì)算的情況,有幾種線蟲混生,就會(huì)得出幾個(gè)樣本的計(jì)算,但松材線蟲的樣本不存在這種情況。從研究結(jié)果看 (圖 2),不同時(shí)間枯死木中的線蟲種類和檢出率是不相同的,但全年基本上能檢測(cè)出松材線蟲。2008年松材線蟲最高檢出率為 100%,平均為 34.59%。1月份,松材線蟲檢出率較高,然后逐月下降,到 6、7月最低;8、9月份又升高。與松材線蟲相反,擬松材線蟲的檢出率是 6、7月份最高,為 75%～100%,年初和年末均較低,全年平均檢出率為 12.65%。松材線蟲檢出率和擬松材線蟲檢出率的這種關(guān)系,可為今后松材線蟲、擬松材線蟲致病性的研究提供借鑒。

圖 2 2008年松枯死木中線蟲分布

3.3 2009年松枯死木中線蟲分布

2009 年 5、10月松材線蟲檢出率 (圖 3)較高 ,分別為 85%、66.07%,1、7、11、12月相差不大,處于 32.44%～37.68%之間。2月份由于樣本數(shù)較少,5份樣本均未檢測(cè)出松材線蟲,結(jié)果不足于說明問題。其它月份檢出率相對(duì)較低,但全年基本上都有松材線蟲枯死樹出現(xiàn),平均松材線蟲檢出率為 28.21%。擬松材線蟲檢出率是 9月份較高,為 25.06%,此時(shí),松材線蟲檢出率較低,為 4.93%。

圖 3 2009年松枯死木中線蟲分布

3.4 2010年松枯死木中線蟲分布

由于時(shí)間關(guān)系,2010年的枯死木檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)到 8月份止。從圖 4可見,松材線蟲檢出率 1月份為 50%,2月份 (樣本較少)最低,然后逐月上升,到 7月份最高,為 73.33%,8月份下降為 40%?；旧厦總€(gè)月都有松材線蟲病枯死木出現(xiàn),平均松材線蟲檢出率為 24.19%。擬松材線蟲的檢出率較低,為 0.53%～2.43%。

圖 4 2010年松枯死木中線蟲分布

3.5 當(dāng)年枯死木快速檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

2010 年 7月 19日,對(duì)當(dāng)年 3～6月常規(guī)檢測(cè)的枯死木樣本進(jìn)行了快速檢測(cè),結(jié)果見表 1。

從表中可見,8、9、10、14、15號(hào)樣本常規(guī)檢測(cè)未檢測(cè)到松材線蟲,但快速檢測(cè)顯色反應(yīng)依然為松材線蟲病木。因當(dāng)時(shí)僅取了枯死木的一處圓盤,松材線蟲在樹體中處于動(dòng)態(tài)變化之中,樹體的其它部位是否有松材線蟲無法知道。對(duì)已檢測(cè)為松材線蟲的樣本,快速檢測(cè)的準(zhǔn)確率達(dá)100%。

表 1 當(dāng)年松枯死木快速檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)檢測(cè)結(jié)果對(duì)比表

3.6 樣本放置 1年后快速檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比

2010 年 7月 11日對(duì) 2009年 3月 30日的剩余樣本進(jìn)行了常規(guī)與快速檢測(cè),結(jié)果見表 2。

表 2 松材線蟲病枯死木放置 1年后快速檢測(cè)與常規(guī)檢測(cè)對(duì)比表

2009年 3月 30日常規(guī)檢測(cè)的結(jié)果為:2號(hào)木的上、中部位和 5號(hào)木的下部無松材線蟲,而2號(hào)木的下部、5號(hào)木的上、中部和其它枯死木均有松材線蟲;3號(hào)木和 4號(hào)木的中、下部位,僅有幼蟲,通過 1個(gè)星期的線蟲培養(yǎng)后,確定為松材線蟲樣本。檢測(cè)后,將樣本直接放在室內(nèi),樣本較干,無霉變現(xiàn)象,隨著樣本含水量的減少,線蟲越來越少。1年后,至 2010年 7月 11日,對(duì)此批樣本再次進(jìn)行常規(guī)檢測(cè),結(jié)果均無松材線蟲和其它線蟲。但快速檢測(cè)結(jié)果顯示,1～5號(hào)木依然為松材線蟲病木。6號(hào)木常規(guī)檢測(cè)鑒定無松材線蟲,但快速檢測(cè)結(jié)果,其上部顯示的是松材線蟲病木。由此可見,利用快速檢測(cè)法,可避免因取樣時(shí)間、取樣部位和松材線蟲量不同所造成的影響,對(duì) 6株、18份樣本的準(zhǔn)確率可達(dá) 94.44%。對(duì) 5株、15個(gè)松材線蟲病木樣本的準(zhǔn)確率達(dá) 100%。

4 小結(jié)

4.1 2008～2010年,福建省松枯死木松材線蟲病檢出率分別為 34.59%、28.21%和 24.19%,呈逐年下降趨勢(shì)。松材線蟲檢出率與季節(jié)的關(guān)系有差異,但常年基本上都有松材線蟲,為枯死木的取樣和松材線蟲病的檢測(cè)鑒定增加了難度。及時(shí)進(jìn)行林間松枯死木的調(diào)查、采樣和室內(nèi)松材線蟲病的檢測(cè)鑒定,在發(fā)病初期就發(fā)現(xiàn),以便采取相應(yīng)的防治措施。

4.2 對(duì)我省松枯死木中線蟲的檢測(cè)鑒定:初步將其分為 4大類:松材線蟲、擬松材線蟲、傘滑刃屬其它線蟲和非傘滑刃屬線蟲。它們?cè)诳菟滥局械墓泊骊P(guān)系有 14種類型,其中松材線蟲和擬松材線蟲混生的情況比較少見,最高僅占 0.27%;2008～2010年,擬松材線蟲 (⑵、⑹～⑽類型)占 14.04%、16.03%和 0.8%。擬松材線蟲對(duì)衰弱的馬尾松有一定的致病性;在干旱脅迫下,擬松材線蟲能明顯加快黑松苗死亡速度[12-13]。近幾年來,我省一些松樹常出現(xiàn)與松材線蟲病相似的癥狀,但連續(xù)幾年的取樣、分離、鑒定結(jié)果是擬松材線蟲。該擬松材線蟲是否具有致病性,以及致病性如何,均有待進(jìn)一步的研究。

4.3 松材線蟲在樹體中處于動(dòng)態(tài)變化之中,松枯死木取樣的時(shí)間、多少、部位等對(duì)檢測(cè)結(jié)果都有一定的影響。2008年,松材線蟲病檢出率最高出現(xiàn)在 1、8、9月;2009年出現(xiàn)在 5、10月;2010年出現(xiàn)在 7月,松材線蟲病檢出率與季節(jié)尚沒有一定的相關(guān)性。為了進(jìn)一步提高松材線蟲病檢測(cè)鑒定的準(zhǔn)確性,應(yīng)在疑是樹的不同部位分別取樣,并增加取樣的次數(shù)、數(shù)量。

4.4 王玉嬿等研究表明:利用指示劑 1號(hào)進(jìn)行快速檢疫檢驗(yàn),馬尾松的準(zhǔn)確率為 89%。本研究認(rèn)為,利用指示劑 1號(hào),對(duì) 26份松材線蟲病枯死木樣本的快速檢測(cè)準(zhǔn)確率達(dá) 100%。利用指示劑 1號(hào)進(jìn)行快速檢測(cè),避免了因取樣時(shí)間、取樣位置等所造成的影響,實(shí)際工作中還是以常規(guī)檢測(cè)鑒定為主。本文數(shù)據(jù)是以研究馬尾松為基礎(chǔ),對(duì)濕地松和黑松等的顯色反應(yīng)如何,有待研究。

致謝:參加部分研究工作的還有黃金水教授級(jí)高工、何學(xué)友教授級(jí)高工、柯玉鑄教授級(jí)高工、湯陳生工程師、蔡守平工程師、曾麗瓊等同志,在此一并致謝!

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DETEM INATI ON M ETHOD AND RESULT ANALYSIS FORW ITHERED PINE WOOD IN FUJIAN

Yang Xi
(1.Fujian Academ y of Forestry Sciences,Fuzhou Fujian350012,China;2.Key Laboratory of Tim ber Forest B reeding and Cultivation forM ountainous A reas in Southern China,State Forestry Adm inistration,Fuzhou Fujian350012,China)

The nor mal deter mination method(Baermann funnelmethod)was applied to study the nematode species,interaction and result in withered pine wood.The nematode was preliminary classified to four categories:B ursaphelenchus xylophilus,Bursaphelenchus m rcronatus,others ofB ursaphelenchusand non-B ursaphelenchus.The interaction in the withered pine wood appeared to be 14 styles:⑴B ursaphelenchus xylophilus;⑵Bursaphelenchus xylophilus,B ursaphelenchusm rcronatusand non-B ursaphelenchus;⑶Bursaphelenchus xylophilusand others ofB ursaphelenchus;⑷B ursaphelenchus xylophilusand non-B ursaphelenchus;⑸B ursaphelenchus xylophilus,others ofB ursaphelenchusand non-B ursaphelenchus;⑹Bursaphelenchus xylophilus,Bursaphelenchus m rcronatus,others ofB ursaphelenchusand non-Bursaphelenchus;⑺B ursaphelenchus m rcronatus;⑻B ursaphelenchus m rcronatusand others ofBursaphelenchus;⑼Bursaphelenchus m rcronatusand non-Bursaphelenchus;⑽B ursaphelenchus m rcronatus,others ofB ursaphelenchusand non-Bursaphelenchus;⑾others ofB ursaphelenchus;⑿others ofB ursaphelenchusand non-Bursaphelenchus;⒀non-Bursaphelenchus⒁no nematode.From 2008 to 2010,34.59%,28.21%and 24.19%of the tested wood were determinated to have nematode,showing that decreased each year;14.04%、16.03%and 0.8%of the tested wood were determinated to haveBursaphelenchus m rcronatus.Every year there was not significant difference be tween the the determination rate of nematode and the seasons,but all around the year the nematode was deter minated,thus the difficulty was increased for sampling the withered wood.The indicatorNo.1 was used to be fast determination,the result showed:its accuracywas100%to the nematodewood.As the time passed,the nematode disappeared gradually from the withered wood,which affected the nor mal deter mination and fast deter mination,thus the best time for deter mination was in initialwithering stages.

withered pine wood;deter mination method;nematode;fast deter mination;Fujian

S763.3

A

1001-4276-(2010)01-0038-09

2010-11-17

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BAD08A19126);福建省科技重大專項(xiàng)子專題(2006NZ0001-2-2);福建省林業(yè)廳項(xiàng)目 (閩林科[2007]函 04號(hào))。

楊希(1963-),女,大學(xué)本科,高級(jí)工程師,研究方向:林木有害生物防控技術(shù)。