陳 鎮(zhèn)， 李永強(qiáng)， 陳文榮， 辛德東， 郭衛(wèi)東

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

短柄櫻桃 (Cerasuspseudocerasuscv. Duanbing) 系中國(guó)櫻桃的優(yōu)良栽培品種之一[1].短柄櫻桃主產(chǎn)浙江，有自花結(jié)實(shí)性好、早果性好、豐產(chǎn)性佳、適應(yīng)性強(qiáng)、果實(shí)大、成熟期早而集中等特點(diǎn)，現(xiàn)已成為中國(guó)南方櫻桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重點(diǎn)品種，并于1992年通過(guò)省級(jí)品種認(rèn)定，為中國(guó)櫻桃中通過(guò)省級(jí)認(rèn)定的少數(shù)品種之一.

設(shè)施栽培能夠使果樹(shù)提前開(kāi)花、結(jié)果，調(diào)節(jié)水果豐淡季、搶占水果市場(chǎng)，極大地提高果品的經(jīng)濟(jì)效益.目前設(shè)施栽培中還存在很多問(wèn)題，設(shè)施內(nèi)的溫度控制，特別是花期的溫度對(duì)果樹(shù)正常開(kāi)花、坐果的影響顯著.為了促進(jìn)桃樹(shù)開(kāi)花，夜溫應(yīng)保持10～15 ℃，最低溫不宜低于5 ℃,從扣棚至開(kāi)花坐果，晝溫逐漸升至20～25 ℃，以不超過(guò)25 ℃為宜[2].甜櫻桃在需冷量得到滿足后，棚內(nèi)溫度開(kāi)始時(shí)要求晝溫在14～16 ℃,最高不宜超過(guò)18～20 ℃，夜溫6～7 ℃最為適宜;開(kāi)花期前后15 d要求晝溫16～18 ℃，最高不宜超過(guò)20～22 ℃，夜溫7～9 ℃最為適宜[3].說(shuō)明各種果樹(shù)依照其固有的生物學(xué)特性，在各個(gè)特定的物候期需要一個(gè)適宜的溫度才能生長(zhǎng)發(fā)育良好.短柄櫻桃作為中國(guó)櫻桃的優(yōu)良品種，在其設(shè)施栽培中對(duì)花期的溫度管理方面還沒(méi)有進(jìn)行系統(tǒng)的研究.本實(shí)驗(yàn)主要是在人工控制條件下，研究溫度對(duì)短柄櫻桃開(kāi)花進(jìn)程及相關(guān)酶活性的影響，以確定短柄櫻桃花器官發(fā)育的適宜溫度范圍，揭示極限溫度對(duì)花芽萌發(fā)的傷害機(jī)理,為科學(xué)制定設(shè)施栽培中花期溫度管理指標(biāo)提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料及其處理

實(shí)驗(yàn)材料采自浙江省金華市金東區(qū)上汪村.2008年12月17日，短柄櫻桃需冷量滿足，結(jié)束自然休眠.在同一試驗(yàn)田中隨機(jī)剪取7年生的長(zhǎng)果枝(約30 cm)，放入盛有9 g/L蔗糖溶液的容器中，將枝條隨即分成6份，每份約70根長(zhǎng)果枝，分別置于夜溫為10 ℃，晝溫為10,15,20,25,30和35 ℃的光照培養(yǎng)箱中，光周期晝/夜(12/12 h)光照強(qiáng)度為2 500 lx，相對(duì)濕度(RH)控制在50%～70%.

每4 d取不同溫度處理的花芽(自頂芽向下第2至第4節(jié)位的花芽)測(cè)定酶活性和丙二醛含量.由于不同溫度下花芽萌發(fā)的速度不同，35和30 ℃處理每4 d到達(dá)一個(gè)開(kāi)花物候期，在1月6日已經(jīng)達(dá)到初花期;而25,20,15和10 ℃ 4個(gè)溫度處理還未完全進(jìn)入開(kāi)花進(jìn)程，故采用兩階段分別比較的方法.第1階段：6個(gè)溫度處理每4 d取材測(cè)定一次.第2階段:在此階段中,35和30 ℃處理的開(kāi)花進(jìn)程已基本結(jié)束，25,20,15和10 ℃ 4個(gè)溫度處理下各開(kāi)花進(jìn)程時(shí)間相差較大，為便于比較,此階段按照開(kāi)花進(jìn)程取材測(cè)定.

1.2 開(kāi)花進(jìn)程的觀察

開(kāi)花進(jìn)程按照以下標(biāo)準(zhǔn)判斷：

花芽膨大期：花芽開(kāi)始膨大，鱗片錯(cuò)開(kāi).

花芽開(kāi)綻期(開(kāi)放期)：鱗片裂開(kāi)，露出綠色葉尖.

花序可見(jiàn)期：花芽外層鱗片脫落，中部出現(xiàn)卷曲狀蓮座葉，花序已可看見(jiàn).

花序分離期：花梗明顯伸長(zhǎng)，花蕾彼此分離.

初花期：全樹(shù)5%的花開(kāi)放.

盛花期：50%花開(kāi)放為盛花期.

1.3 POD 酶活性的測(cè)定

過(guò)氧化物酶(POD)活性按照文獻(xiàn)[4]的方法測(cè)定.提取液為pH 7.8的磷酸緩沖液(含10 g/L的聚乙烯吡咯烷酮(PVP));反應(yīng)混合液為50 mL pH 6.0的磷酸緩沖液，其中含28 μL的愈創(chuàng)木酚和19 μL 30%的過(guò)氧化氫溶液.根據(jù)470 nm波長(zhǎng)下吸光度的增加計(jì)算酶活性，以在470 nm波長(zhǎng)下每分吸光度的增加定義為1個(gè)單位酶活性.

1.4 CAT 酶活性的測(cè)定

過(guò)氧化氫酶(CAT)活性通過(guò)測(cè)定H2O2在240 nm波長(zhǎng)下的分解率[5]來(lái)表示.取植物樣0.1 g，用提取液(pH 7.8磷酸緩沖液和10 g/L的PVP)冰浴提取，6 000 r/min離心20 min后，取上清液,即為所需測(cè)定的酶液.取2個(gè)100 mL三角燒瓶，編號(hào)為1和2，各加入酶液1 mL和提取液9 mL，馬上向2號(hào)瓶中加入3.6 mol/L H2SO4溶液5 mL以終止酶活動(dòng)，作為對(duì)照.將各瓶置于20 ℃水浴中保溫20 min，加入0.1 mol/L H2O2溶液5 mL，在水浴中保溫作用5 min；向1號(hào)瓶中加入5 mL 3.6 mol/L H2SO4溶液；再向2個(gè)瓶中各加入1 mL 200 g/L KI溶液，3滴100 g/L鉬酸銨溶液，5滴10 g/L淀粉指示劑后，用0.02 mol/L Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至藍(lán)色消失.

1.5 SOD酶活性的測(cè)定

超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)法[6]測(cè)定.稱取植物樣0.5 g，用5 mL提取液(pH 7.8的磷酸緩沖液和10 g/L的PVP)冰浴提取，6 000 r/min離心20 min后，取上清液，即為所需測(cè)定的酶液.在試管中加入3 mL反應(yīng)混合液(在54 mL 14.5 mmol·L-1的甲硫氨酸溶液中分別加入均以pH 7.8的磷酸緩沖液配制的3 μmol·L-1EDTA溶液、2.25 mmol·L-1NBT溶液和60 μmol·L-1核黃素溶液各2 mL)和20 uL酶液，混合后光照10 min，以反應(yīng)混合液為對(duì)照迅速測(cè)定A560.1 U的SOD定義為使NBT光還原速率抑制50%所需要的酶活性.

1.6 丙二醛含量的變化

取不同溫度處理下的花芽測(cè)定有毒物質(zhì)丙二醛(MDA)含量的變化.膜脂過(guò)氧化程度用丙二醛(MDA)含量表示.測(cè)定方法采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法[7].稱取植物樣0.2 g，于液氮中磨成粉末，然后加入100 g/L三氯乙酸(TCA)溶液2 mL研磨至勻漿，再加入8 mL TCA溶液進(jìn)一步提取，提取物離心后取2 mL上清液與2 mL 6 g/L TBA溶液(用100 g/L TCA溶液配制)混合，混合物在90 ℃水浴加熱20 min，冰浴結(jié)束反應(yīng)，反應(yīng)液離心后取上清液測(cè)定在532,600和450 nm波長(zhǎng)下的吸光度，MDA的濃度(單位:μmol/L)按

CMDA=6.45(A532-A600)-0.56A450

計(jì)算.

1.7 可溶性蛋白含量測(cè)定

可溶性蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250 法[8].

1.8 數(shù)據(jù)處理

各項(xiàng)指標(biāo)重復(fù)3次測(cè)定，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用DPS數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn)，用Orgin 7.0軟件作圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)開(kāi)花進(jìn)程的影響

不同溫度處理對(duì)短柄櫻桃開(kāi)花進(jìn)程的影響顯著(見(jiàn)表1).總體而言，隨著處理溫度的升高，開(kāi)花所需的時(shí)間逐漸縮短.35 ℃處理4 d后花芽開(kāi)始膨大，鱗片錯(cuò)開(kāi)，12 d后到達(dá)花序可見(jiàn)期，發(fā)育最快，但此后絕大多數(shù)花芽停止發(fā)育，10%的花芽繼續(xù)生長(zhǎng)至花序分離期，但花柄未露出便停止生長(zhǎng)，花蕾和未展開(kāi)的萼片上有明顯的褐色灼傷痕跡，最后全部不能正常開(kāi)花而脫落.30 ℃處理組與35 ℃處理組比較，在開(kāi)花進(jìn)程時(shí)間上基本吻合，兩者發(fā)育到花序可見(jiàn)期所需時(shí)間基本相同.在開(kāi)花進(jìn)程時(shí)間上，25 ℃處理組比20 ℃處理組提早2 d；但15和10 ℃處理組開(kāi)花所需時(shí)間明顯長(zhǎng)于其他各組，整個(gè)開(kāi)花進(jìn)程分別耗時(shí)66及75 d.

表1 溫度對(duì)短柄櫻桃開(kāi)花進(jìn)程的影響

2.2 溫度對(duì)花芽MDA含量的影響

為揭示極限溫度條件下短柄櫻桃花芽的生理代謝受脅迫的程度，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了6個(gè)溫度處理下短柄櫻桃花芽中丙二醛(MDA)含量的變化，探討了不同溫度下膜脂過(guò)氧化作用的情況.

MDA是膜脂過(guò)氧化作用的產(chǎn)物，其含量可以揭示膜脂過(guò)氧化作用的程度,進(jìn)而反映植物受逆境脅迫的程度.第1階段(見(jiàn)圖1)，35和30 ℃處理組基本上每4 d到達(dá)一個(gè)開(kāi)花物候期，即12月21日、25日和29日,1月2日和6日分別為花芽膨大期、開(kāi)綻期、花序可見(jiàn)期、花序分離期及初花期，而其余4個(gè)溫度處理還未完全進(jìn)入開(kāi)花進(jìn)程.從處理開(kāi)始至12月29日，6個(gè)溫度處理組的花芽MDA含量無(wú)顯著性差異(P>0.05)；在處理至12月29日后，30和35 ℃處理下的花芽(處于花序可見(jiàn)期)中MDA含量開(kāi)始快速上升，而其他4個(gè)溫度下的花芽MDA含量變化比較平穩(wěn)，無(wú)顯著性差異(P>0.05).第2階段，雖然各處理溫度條件下短柄櫻桃開(kāi)花進(jìn)程所需的時(shí)間相差較大，但各進(jìn)程階段花芽?jī)?nèi)MDA含量的變化具有明顯的規(guī)律性，即25 ℃處理組在花序可見(jiàn)期后MDA含量開(kāi)始升高，并持續(xù)到初花期，而其他3個(gè)溫度處理組花芽中MDA含量變化平穩(wěn)，無(wú)特殊規(guī)律，也無(wú)顯著性差異(P>0.05).

圖1 不同溫度下短柄櫻桃花芽中MDA含量的變化

2.3 溫度對(duì)花芽POD,CAT和SOD活性的影響

超氧化物氧化酶(SOD)是植物抗氧化酶系統(tǒng)的主要成員之一，在植物體內(nèi)負(fù)責(zé)將O·-2歧化為O2和H2O2，以減緩葉綠素、蛋白質(zhì)的降解，增強(qiáng)機(jī)體的抗逆性.由圖2可見(jiàn)，10,30和35 ℃ 3個(gè)處理組花芽中SOD的活性均是先上升后下降，35 ℃處理組的SOD活性最高，但高峰以后SOD活性又低于前兩者.其他處理組的SOD活性則一直保持著平穩(wěn)的狀態(tài).

由圖3可見(jiàn)，在逆境溫度下H2O2的積累激發(fā)了POD的活性.30和35 ℃處理組花芽中POD活性從12月25日開(kāi)始持續(xù)上升.25 ℃處理組在花序可見(jiàn)期和花序分離狀態(tài)下POD活性達(dá)到高峰.

CAT活性的變化與SOD基本相似，如圖4所示，30和35 ℃ 2個(gè)處理組花芽的CAT活性前期上升，后期迅速下降;而25 ℃處理組在花序分離期CAT活性達(dá)到峰值,而后迅速下降.

圖2 不同溫度下短柄櫻桃花芽SOD活性的變化

圖3 不同溫度下短柄櫻桃花芽POD活性的變化

圖4 不同溫度下短柄櫻桃花芽CAT活性的變化

2.4 溫度對(duì)花芽可溶性蛋白含量的影響

不同溫度處理下，短柄櫻桃花芽中可溶性蛋白含量升高的時(shí)間與花芽萌發(fā)進(jìn)程吻合(見(jiàn)圖5).在花芽萌發(fā)進(jìn)程中，可溶性蛋白含量一直在升高，主要升高階段是在花序可見(jiàn)期至初花期.當(dāng)花芽進(jìn)入萌動(dòng)時(shí)期，枝條活動(dòng)旺盛，韌皮部中在休眠期積累的營(yíng)養(yǎng)輸送到花芽中，因此花芽中蛋白含量迅速升高，以保證花芽萌發(fā)的正常進(jìn)行.

圖5 不同溫度下短柄櫻桃花芽可溶性蛋白含量的變化

3 討 論

膜的穩(wěn)定性是維持細(xì)胞正常生命活動(dòng)的基本條件.在高溫脅迫下，組織中的氧化物自由代謝失調(diào)引起膜脂過(guò)氧化作用增強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜透性增加等傷害的發(fā)生，MDA含量被廣泛用于指示植物細(xì)胞膜系統(tǒng)完整性及受脅迫的程度.研究表明:在雄性敗育的花器官中，脂膜的破壞比在可育花器中快得多；在育性表達(dá)的關(guān)鍵期，H2O2，R-，O2，OH-等含量上升，引起膜脂過(guò)氧化加劇，其產(chǎn)物MDA含量上升.在水稻[9]、小麥[10]、玉米[11]及油菜[12]等不育材料中都發(fā)現(xiàn)了較高的氧自由基和MDA含量.在處理14 d后,35和30 ℃處理短柄櫻桃花芽中MDA含量開(kāi)始升高，25 ℃處理組在花序可見(jiàn)期MDA含量開(kāi)始升高，說(shuō)明極限溫度造成的膜脂過(guò)氧化作用導(dǎo)致細(xì)胞膜透性增加，失去其選擇性透過(guò)的功能.通過(guò)短柄櫻桃花芽萌發(fā)過(guò)程中MDA含量的變化可以看出,35，30和25 ℃處理短柄櫻桃均是在花序可見(jiàn)期后MDA含量開(kāi)始快速上升的.

相關(guān)研究表明，高溫脅迫引起的膜脂過(guò)氧化過(guò)程中氧自由基O·-2，H2O2等有毒物質(zhì)的產(chǎn)生速度與保護(hù)酶系統(tǒng)在高溫下的活性共同決定著植物的耐熱性.植物酶促防御系統(tǒng)，包括超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT) 等是消除自由基的重要酶，它們可以減輕膜脂過(guò)氧化的程度，保持膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性.POD被認(rèn)為通過(guò)自身的消耗清除了因代謝失調(diào)引起的過(guò)多氧自由基，從而保護(hù)了細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，提高植物的耐熱性.研究表明,草地早熟禾在熱脅迫時(shí)過(guò)氧化物酶(POD)活性先下降后升高[13];司家鋼等研究發(fā)現(xiàn)不管是耐熱還是熱敏大白菜品種，其POD活性在高溫下均下降，耐熱強(qiáng)的品種POD活性變化較大[14].在正常條件下，SOD 等活性氧清除劑能有效地清除機(jī)體內(nèi)破壞力極強(qiáng)的活性氧;在高溫脅迫下,花芽中SOD 活性下降，造成膜脂過(guò)氧化作用加劇，使膜系統(tǒng)進(jìn)一步受到傷害.短柄櫻桃在高溫脅迫下(35，30和25 ℃處理)，花芽中的SOD和CAT活性均在花序可見(jiàn)期升至峰值，然后急劇下降，說(shuō)明其活性受到抑制，使超氧化物自由基、過(guò)氧化氫等活性氧不能有效地清除，過(guò)剩的活性氧會(huì)攻擊大分子和生物膜，使膜脂過(guò)氧化作用增強(qiáng)，從而引起傷害.而POD的活性在脅迫發(fā)生后迅速上升，說(shuō)明與傷害的程度呈正相關(guān).

隨著晝溫的提高，短柄櫻桃的花期相應(yīng)提前，高溫處理會(huì)對(duì)花藥發(fā)育的特定過(guò)程造成傷害.本研究已證明:在晝溫35，30和25 ℃條件下，花芽中MDA含量及抗氧化酶活性均在花序可見(jiàn)期變化較大.花序可見(jiàn)期鱗片進(jìn)一步錯(cuò)開(kāi)、脫落，小花外層的包片也脫落，此時(shí)花剛露出，對(duì)外界環(huán)境適應(yīng)性較差，對(duì)溫度較為敏感.所以,設(shè)施栽培中花期溫度管理應(yīng)該從扣棚開(kāi)始，晝溫不超過(guò)25 ℃，保持在20～25 ℃為宜，這樣能加快物候期的進(jìn)程，提早開(kāi)花，增加坐果率.

[1]李建華,戚行江,梁森苗,等.中國(guó)櫻桃品種諸暨短柄櫻桃[J].園藝學(xué)報(bào),2007,34(4):1065.

[2]沈元月,郭家選,劉成連,等.溫度對(duì)桃花器官發(fā)育的影響[J].園藝學(xué)報(bào),1999,26(1):1-6.

[3]孫維洋.不同溫度對(duì)保護(hù)地甜櫻桃花器官發(fā)育的影響及促花措施的研究[D].泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2000.

[4]張志良.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京:高等教育出版社,2000.

[5]陳文榮.水稻(OryzasativaL.)鋅高效營(yíng)養(yǎng)生理機(jī)制研究[D].杭州:浙江大學(xué),2008.

[6]Liu Peng,Yang Yuesuo,Xu Gendi,et.at.Physiological response of rare and endangered seven-son-flower (Heptacodiummiconioides) to light stress under habitat fragmentation[J].Environ Exp Bot,2006,57(1):32-40.

[7]湯章誠(chéng).現(xiàn)代植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指南[M].北京：科學(xué)出版社,1999:305-306.

[8]李合生.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M].北京：高等教育出版社,2000:184-185.

[9]陳賢豐,梁承鄴.水稻不育花藥中H2O2的積累與膜脂過(guò)氧化的加劇[J].植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào),1991,17(1):44-48.

[10]趙會(huì)杰,劉華山,林學(xué)梧,等.小麥胞質(zhì)不育系花粉敗育與活性氧代謝關(guān)系的研究[J].作物學(xué)報(bào),1996,22(3):365-367.

[11]段俊,梁承鄴,張明永.玉米細(xì)胞質(zhì)雄性不育性與膜質(zhì)過(guò)氧化的關(guān)系[J].植物生理學(xué)通訊,1996,32(5):331-334.

[12]張明永,梁承鄴,段俊.油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系發(fā)育進(jìn)程中活性氧的代謝[J].植物學(xué)報(bào),1997,39(5):480-482.

[13]何亞麗,沈劍,王惠林.冷地型草坪草耐熱機(jī)理初探I.草地早熟禾在熱境脅迫下葉片葉綠素含量和POD酶活性的變化[J].上海農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),1997,15(2):128-132.

[14]司家鋼,孫日飛,吳飛燕,等.高溫脅迫對(duì)大白菜耐熱性相關(guān)生理指標(biāo)的影響[J].中國(guó)蔬菜,1995,15(4):4-6.