張宗祥,陳 軍

(泰州市環(huán)境監(jiān)測中心站,江蘇 泰州 225300)

高效液相色譜法測定魚肌肉中的孔雀石綠殘留

張宗祥,陳 軍

(泰州市環(huán)境監(jiān)測中心站,江蘇 泰州 225300)

采用高效液相色譜法測定魚組織中孔雀石綠的殘留量。樣品經(jīng)高速均質(zhì)后,用乙腈提取,合并提取液,用二氯甲烷再次萃取,有機(jī)相濃縮后過酸性氧化鋁和 PRS復(fù)合小柱洗脫,用乙腈定容。以乙腈 -乙酸鹽緩沖溶液為流動相,高效液相色譜分離,用熒光檢測器檢測,外標(biāo)法定量。其檢出限為 0.75μg/kg,加標(biāo)回收率為 84.0%～90.1%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD為 2.98%～6.21%。

高效液相色譜;孔雀石綠;魚體

0 引言

孔雀石綠是三苯基甲烷類工業(yè)染料,是藥用染料中抗菌效力較強(qiáng)的一類,廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品養(yǎng)殖業(yè),常用于防治魚的增殖性腎病、水霉病、爛鰓病以及寄生蟲病等,也可在水產(chǎn)品販運(yùn)過程中用作消毒劑,以延長魚類的存活時(shí)間?？兹甘G被魚體吸收后,可代謝為隱色孔雀石綠,并沉積在脂肪組織中,具有明顯的殘留現(xiàn)象,其殘留時(shí)間達(dá)到 100d以上。動物試驗(yàn)證明孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物對人畜有潛在的致畸、致癌和致突變作用,且代謝產(chǎn)物隱色孔雀石綠的危害更甚于其母體,故被我國及世界上很多國家禁止使用。

目前,檢測孔雀石綠殘留大多采用高效液相色譜法,紫外檢測方法需要二氧化鉛柱后衍生,過程繁瑣。本實(shí)驗(yàn)參考 GB/T 20361—2006方法并作部分改良,將孔雀石綠還原成隱色孔雀石綠,采用熒光檢測器,可以有效避免雜質(zhì)干擾,具有高靈敏度,適合水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留的檢測。

1 試 驗(yàn)

1.1 主要儀器和試劑材料

Waters 2695高效液相色譜儀,Waters 2475熒光檢測器,超聲波細(xì)胞破碎儀,高速離心機(jī),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品 100mg/L,乙腈、二氯甲烷均為色譜純,20%鹽酸羥胺溶液、對甲苯磺酸、冰乙酸為分析純,硼氫化鉀 (純度大于 95%)、二甘醇 (化學(xué)純),酸性氧化鋁固相萃取柱 1g/3mL,PRS固相萃取柱 500mg/3mL。

1.2 樣品預(yù)處理

將魚體去鱗洗凈,割取背部肌肉 5.00g置于50mL離心管中,依次加入 10mL乙腈、1.5mL鹽酸羥胺溶液、2.5mL對甲苯磺酸溶液和 5mL乙酸銨緩沖溶液,渦旋 2min,超聲波破碎 10min。加入 5g酸性氧化鋁,渦旋 2min,10 000r/min離心 15min。殘?jiān)屑尤?10mL乙腈,渦旋 2min后,10 000r/min離心15min。合并 2次上層清液至分液漏斗中。

于上層清液中分別加入 2mL二甘醇、3mL硼氫化鉀溶液和 30mL二氯甲烷,振搖 5min,靜置分層10min。取有機(jī)相于 45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干,加入2.5mL乙腈溶解。

將上述液體過酸性氧化鋁柱 (下接 PRS小柱),并以 5mL乙腈分 2次洗滌旋蒸燒瓶,一并過柱。棄去酸性氧化鋁柱,將 PRS小柱吹至近干,加 3mL乙腈淋洗液,收集流出液并用乙腈定容至 3mL,過0.45μm,供液相色譜測定。

1.3 色譜分析條件

色譜柱 ：Atlantis dC18(4.6mm ×250mm,5μm)。

流動相：乙腈 -乙酸銨緩沖液 (pH=4.5),體積比為 80∶20。

進(jìn)樣量：10μL。

流速 ：1.0mL/min。

柱溫：35℃。

激發(fā)波長：265nm。

發(fā)射波長：360nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 二氯甲烷和乙腈的比例

應(yīng)適當(dāng)增加二氯甲烷的萃取用量,否則萃取操作不容易進(jìn)行。試驗(yàn)中,乙腈的用量為 20mL,當(dāng)乙腈 ∶二氯甲烷 (V∶V)=1∶1時(shí),由于乙腈對水的溶解度較大,分層不明顯,萃取效率低下。試驗(yàn)中,二氯甲烷的加入量為 30mL,既縮短了分離時(shí)間,又提高了提取的效率。

2.2 洗脫液 pH

PRS為丙磺酸柱,在強(qiáng)堿性條件下才能將隱色孔雀石綠洗脫下來,乙腈洗脫液應(yīng)用氨水調(diào)節(jié)在 pH值 =10左右。堿性過低,洗脫不下來;堿性過高,易損傷色譜柱。

2.3 色譜圖和標(biāo)準(zhǔn)曲線

取孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,按色譜條件進(jìn)行測定,以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度對峰面積制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,孔雀石綠的濃度在 5μg/L～100μg/L范圍內(nèi)呈線性,標(biāo)準(zhǔn)曲線為 ：A=28 733.71C-5 400;R2=0.999 8(圖1、圖 2)。

圖1 孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

2.4 回收率和精密度

在空白樣品中分別以 1μg/kg、5μg/kg和 10μg/kg的水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),結(jié)果見表 1。

表1 回收率及精密度試驗(yàn)(n=6)

2.5 檢出限

在 5.0g空白樣品中添加 5.0μg/mL標(biāo)樣1.00mL,得到加標(biāo)濃度為 1.0μg/kg的樣品,進(jìn)行平行測定 6次,以 3倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算檢測限,本試驗(yàn)中孔雀石綠的檢出限為 0.75μg/kg。

3 結(jié) 語

建立了魚體中孔雀石綠檢測的高效液相色譜 -熒光法。利用熒光檢測器的選擇性可以有效降低雜質(zhì)峰的干擾,獲得滿意的檢測結(jié)果。方法最低檢出限 0.75μg/kg,加標(biāo)回收率為 81.7%～90.1%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 2.98%～6.21%。本方法具有簡便、快捷,精密度和準(zhǔn)確度高的特點(diǎn),適合對魚體內(nèi)孔雀石綠殘留的檢測。

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[3]SN/T 1479—2004,進(jìn)出口水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量的測定方法[S].

[4]SC/T 3021—2004,水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量的測定[S].

[5]GB/T 19857—2005,水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留的測量[S].

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Determination of residues ofmalachite green in fish tissues by high-perfor mance liquid chromatography

(Taizhou Station of EnvironmentalMonitoring,Taizhou 225300 Jiangsu)

A high-performance liquid chromatography(HPLC)methodwas established for the determination ofmalachite green in fish tissues.The tissueswere blended thoroughly under acidic medium,chloride was used for re-extraction after the former extracts were combined.After evaporation,the organic phase was passed through the acid alumina column and PRS column,then resolved with acetonitrile.Taking acetonitrile-acetate buffer as the mobile phase,the residue levelswere determined by HPLC with fluorescence detector.External standard calibrationwas adopted in the deter mination.The detection limitwas0.75μg/kg,the valuesof recovery found by standard addition method were in the range of 84.0%～90.1%,and values of RSD were in the range of 2.98%～6.21%.

HPLC;Malachite green;Fish tissues

ZHANG Zong-x iang,CHEN Jun

S914

A

1674-3636(2010)02-0206-03

2010-01-12;編輯：侯鵬飛

張宗祥 (1976—),男,工程師,碩士,主要從事環(huán)境監(jiān)測工作.

10.3969/j.issn.1674-3636.2010.02.206