[摘要]目的:本研究的目的是探討肥大細胞在非剝脫性激光嫩膚中的作用。方法:應用長脈寬1 064nm摻釹:釔-鋁石榴石(neodymium-yttrium-aluminum garnet， Nd:YAG)激光對36只雌性昆明小鼠進行連續(xù)4次治療，每次間隔1周。分別于第1次治療后1h、1天、7天、21天、30天、60天對小鼠皮膚行活組織取材。應用甲苯胺藍特殊染色、蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin， HE)染色和免疫組化方法分別對皮膚組織樣品真皮肥大細胞、成纖維細胞和I型、III型膠原進行檢測。結果:激光治療后1h、1天、7天、21天和30天，治療組真皮肥大細胞總數(shù)較正常對照組明顯增高(均為P<0.01);激光治療后1h、1天、7天、21天、30天和60天，治療組真皮脫顆粒的肥大細胞數(shù)量較正常對照組均明顯增高(分別為P<0.01、P<0.01、P<0.01、P<0.05、P<0.01、P<0.01);激光治療后7天、21天、30天和60天，治療組真皮成纖維細胞數(shù)量較正常對照組明顯增高(分別為P<0.05、P<0.01、P<0.01、P<0.01);激光治療后21天、30天、60天，治療組真皮I型膠原水平較正常對照組明顯增高(分別為P<0.01);激光治療后7天、21天、30天和60天，治療組真皮III型膠原水平較正常對照組明顯增高(分別為P<0.01、P<0.05、P<0.01、P<0.01)。真皮脫顆粒的肥大細胞數(shù)量與真皮成纖維細胞數(shù)量呈顯著正相關(r=0.663， P<0.01);真皮脫顆粒的肥大細胞數(shù)量與真皮I型及III型膠原水平亦分別呈顯著正相關(分別為r=0.558， P<0.01;r=0.630， P<0.01)。結論:肥大細胞可能參與非剝脫性激光誘導的炎癥反應、成纖維細胞增生和膠原重建。

[關鍵詞]非剝脫性激光嫩膚;膠原重建;肥大細胞;Nd:YAG激光;創(chuàng)傷愈合

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455(2010)05-0697-04

The role of mast cells in nonablative rejuvenation with long-pulse 1064nm Nd:YAG laser

SHANG Ying-bin1，2，WANG Zhan1，PANG Ying1，XI Peng1，REN Qiu-shi1

(1.Institute for Laser Medicine and Bio-Photonics， Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200240， China;2. Cosmetology Skin Center， Sichuan Mylike Cosmetic Hospital， Chengdu 610041， Sichuan， China)

Abstract:ObjectiveThe aim of this study was to investigate the role of mast cells in nonablative laser rejuvenation. Methods The dorsal skin of Kunming (KM) mice was exposed by long-pulse 1064nm neodymium-yttrium-aluminum garnet (Nd:YAG) laser weekly for four consecutive weeks. Biopsies were performed 1 hour after irradiation and 1，7，14，30 and 60 days after the first treatment. Skin samples were studied for mast cells，fibroblasts，type I and III collagen applying toluidine blue， hematoxylin-eosin (HE) and immunohistochemistry staining， respectively. Results The total number of mast cells in the skin of experimental group was significantly greater than that in control at 1hour，1 day，7days，21 days and 30 days after the first treatment (P<0.01， respectively). At any of the time points studied，the number of degranulated mast cells in experimental group was significantly higher than in the control (P<0.01， P<0.01， P<0.01， P<0.05， P<0.01， P<0.01， respectively). The number of fibroblasts in experimental group exhibited a significant increase as compared with control skin at days 7， 21， 30 and 60 after irradiation (P<0.05， P<0.01，P<0.01， P<0.01， respectively). The amount of type I collagen was significantly higher than in the control from day 21 to 60 (P<0.01，respectively)， and type III collagen showed a marked increase between day 7 and day 60 compared with control (P<0.01，P<0.05， P<0.01， P<0.01， respectively). There was a significant positive correlation between the number of fibroblasts and granulated mast cells (r=0.732， P<0.01). The amount of type I and III collagen also showed significant positive correlations with the number of degranulated mast cells (r=0.654，P<0.01 and r=0.671，P<0.01，respectively). ConclusionThe results suggested that dermal mast cells might be involved in inflammatory response， fibroblast proliferation and collagen remodeling induced by nonablative laser treatment.

Key words: nonablative laser rejuvenation; collagen remodeling; mast cells; Nd:YAG laser; wound healing

與傳統(tǒng)的激光嫩膚技術即剝脫性激光嫩膚技術相比，非剝脫激光嫩膚技術具有療效確切、副作用小的優(yōu)點[1-2]，因此在治療光老化方面越來越受到廣泛關注。關于非剝脫性激光與皮膚組織相互作用的方式，目前認為非剝脫性激光保持表皮的完整性，而只對真皮造成損傷，從而啟動了機體的創(chuàng)傷修復反應，引起成纖維細胞增生、I型和III型膠原生成和真皮基質重建[3-4]。然而，非剝脫性激光確切的嫩膚機制目前仍不完全明了。

正常的創(chuàng)傷修復反應是一個復雜的生物學過程，其中有許多細胞及其產物參與。眾所周知，肥大細胞是在免疫球蛋白(immunoglobulin， Ig)E介導的I型超敏反應中起中心作用的細胞，但近年的研究表明肥大細胞亦參與創(chuàng)傷愈合過程[5]。肥大細胞脫顆?？烧T導炎性反應、成纖維細胞增生和膠原重建，這恰是創(chuàng)傷愈合過程的關鍵步驟[5-6]。

本研究的目的是評價非剝脫性長脈寬1064nm Nd:YAG激光誘導真皮熱創(chuàng)傷修復反應中肥大細胞的作用，以揭示非剝脫性激光的嫩膚機制。

1材料和方法

1.1 實驗動物:雌性昆明小鼠36只，8～10周齡，體重約30g， 由復旦大學上海醫(yī)學院實驗動物中心提供，按取材時間點不同隨機分6組，每組6只。

1.2 激光照射:實驗前24h將小鼠背部皮膚應用市售脫毛膏行脫毛處理。在10%水合氯醛1ml/kg腹腔內注射麻醉下左側皮膚行長脈寬1064nm Nd:YAG激光(Coolglide，Cutera公司， 美國)照射，右側皮膚作為自身部位對照。根據(jù)文獻[7]所描述的治療參數(shù)進行激光照射。能量密度30J/cm2，脈寬0.3ms，光斑6mm。光斑有10%重疊，每個部位重復照射3遍。共治療4次，每次間隔1周。第1次激光治療后1h、1天、7天、21天、30天、60天分別對小鼠皮膚激光治療組和正常對照組進行活組織取材，其中第3次和第4次取材是在相應的治療前，以避免激光引起的急性炎癥的影響。皮膚組織取下后立即放入10%福爾馬林中固定。

1.3 皮膚組織病理檢查:皮膚組織經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋，常規(guī)切片后行HE染色。組織切片中成纖維細胞核被染成藍色，在400×顯微鏡下隨機選取3個視野計數(shù)成纖維細胞核數(shù)，取平均值，代表成纖維細胞數(shù)。

1.4 甲苯胺藍特殊染色:組織切片應用1%甲苯胺藍染液進行染色，染色時間以肥大細胞異染顆粒呈紫紅色為宜。每個切片隨機選取20個視野，于200×顯微鏡下計數(shù)每個視野染色陽性細胞數(shù)，取平均值，即肥大細胞總數(shù)。然后在400×顯微鏡下對每個視野中脫顆粒的肥大細胞進行判定(脫顆粒的肥大細胞的判定參照文獻[8]，以400×下觀察8個顆粒脫出到細胞膜外定義為脫顆粒的肥大細胞)，取平均值，即為脫顆粒的肥大細胞數(shù)。

1.5 免疫組化實驗:應用鏈酶親和素-生物素-酶復合物(StreptAvidin-Biotin-enzyme Complex， SABC)染色試劑盒(博士德生物工程有限公司，武漢)，一抗為兔抗小鼠I、III型膠原多克隆IgG抗體(博士德生物工程有限公司，武漢)，實驗步驟按說明書操作。實驗結果應用Motic醫(yī)學數(shù)字圖像分析系統(tǒng)對DAB陽性染色的切片進行定量分析。400×下隨機選取3個視野，分別計算小鼠真皮I、III型膠原陽性表達面積和統(tǒng)計場總面積的百分比，取平均值。

1.6 統(tǒng)計學處理:所測得的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±s)表示，應用SPSS15.0軟件對數(shù)據(jù)進行t檢驗，不同變量間的相關性檢驗應用Pearson 相關分析，P<0.05認為有統(tǒng)計學意義。

2.1 肥大細胞甲苯胺藍染色:經(jīng)甲苯胺藍染色，小鼠真皮可見肥大細胞分布，卵圓形、紡錘形或不規(guī)則形，肥大細胞核呈藍色，胞質顆粒呈紫紅色，多分布于血管和毛囊附近。見圖1、2。

2.1.1 肥大細胞總數(shù):見表1，激光治療后1h治療組真皮肥大細胞總數(shù)開始明顯升高，21天時達到高峰，30天時較21天略下降，60天時明顯降低。治療組與正常對照組進行比較發(fā)現(xiàn):激光治療后1h～30天，治療組真皮肥大細胞總數(shù)較正常對照組明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(均為P<0.01)。

2.1.2 脫顆粒的肥大細胞計數(shù):見表1，激光治療后1h治療組真皮脫顆粒的肥大細胞數(shù)量開始明顯升高，30天時達到高峰，60天時較30天有所降低。治療組與對照組進行比較發(fā)現(xiàn):激光治療后1h～60天，治療組真皮脫顆粒的肥大細胞數(shù)量較正常對照組均明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(分別為P<0.01、P<0.01、P<0.01、P<0.05、P<0.01、P<0.01)。

2.2 成纖維細胞計數(shù):見表2，激光治療后1h和1天，治療組真皮成纖維細胞數(shù)量無明顯變化，7天時明顯升高，30天時達到高峰，60天時較30天稍下降。治療組與正常對照組進行比較發(fā)現(xiàn):激光治療后7～60天，治療組真皮成纖維細胞數(shù)量較正常對照組明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(分別為P<0.05、 P<0.01、 P<0.01、P<0.01)。

2.3 真皮I型和III型膠原水平

2.3.1 真皮I型膠原水平:見表3，激光治療后1h～7天治療組真皮I型膠原水平無明顯變化，21天時開始明顯升高，一直持續(xù)增高，60天時達高峰。治療組與正常對照組進行比較發(fā)現(xiàn):激光治療后21～60天，治療組真皮I型膠原水平較正常對照組明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(均為P<0.01)。

2.3.2 真皮III型膠原水平:見表3，激光治療后1h和1天，治療組真皮III型膠原水平無明顯變化，7天后開始明顯升高，一直持續(xù)增高，30天時達到高峰，60天時較30天有所降低。治療組與正常對照組進行比較發(fā)現(xiàn):激光治療后7～60天，治療組真皮III型膠原水平較正常對照組明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(分別為P<0.01、P<0.05、P<0.01、P<0.01)。

2.4 真皮脫顆粒的肥大細胞數(shù)量與真皮成纖維細胞數(shù)量及I型和III型膠原水平相關性分析結果:真皮脫顆粒的肥大細胞數(shù)量與真皮成纖維細胞數(shù)量呈顯著正相關，差異有統(tǒng)計學意義(r=0.663， P<0.01);真皮脫顆粒的肥大細胞數(shù)量與真皮I型及III型膠原水平亦分別呈顯著正相關，差異有統(tǒng)計學意義(分別為r=0.558， P<0.01;r=0.630，P<0.01)。

3討論

非剝脫性激光選擇性誘導真皮可控性損傷，而不破壞表皮，從而刺激了機體的創(chuàng)傷愈合反應，導致皮膚膠原生成和真皮基質重建。其中，長脈寬1064nm Nd:YAG激光是較新型的具有代表性的非剝脫性激光，屬于紅外激光，穿透皮膚組織較深，約5mm，脈寬較長，達毫秒級，主要是對靶組織產生選擇性光熱效應，進而通過后續(xù)反應達到嫩膚效果。一系列研究證實了長脈寬1064nm Nd:YAG激光的臨床和組織學療效，但其確切的嫩膚機制目前尚不明確。

皮膚創(chuàng)傷愈合過程分為3個相互重疊的階段，包括炎癥期、增生期和重建期[5，9]，是機體對創(chuàng)傷的正常病理反應，使受損的組織恢復正常的結構和功能。在創(chuàng)傷愈合過程中，皮膚常駐細胞和炎性細胞包括角質形成細胞、成纖維細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、肥大細胞及可溶性介質相互作用，刺激特異性細胞趨化、誘導特異性細胞株增生和調控細胞外基質結構的重建。研究表明肥大細胞是創(chuàng)傷愈合中的關鍵細胞群，在創(chuàng)傷愈合的3個階段均起作用。肥大細胞可被各種外源性和內源性因素激活，這些刺激因素包括IgE、神經(jīng)肽、趨化因子、及物理因素、化學因素和機械性因素如創(chuàng)傷、熱、紫外線等，直接作用于肥大細胞膜或通過刺激與肥大細胞接觸的局部感覺神經(jīng)末梢的間接作用，使肥大細胞脫顆粒。通過脫顆粒，肥大細胞合成的和貯存在胞漿顆粒中具有生物學活性的介質被釋放出來，發(fā)揮生物學作用。在創(chuàng)傷愈合早期炎癥期(數(shù)天)，肥大細胞可釋放幾種血管活性介質包括組胺、絲氨酸蛋白酶、細胞因子等，使血管通透性增強，出現(xiàn)水腫反應;在增生期，肥大細胞可促進成纖維細胞、內皮細胞和角質形成細胞增生;在重建期，肥大細胞通過釋放絲氨酸蛋白酶、多功能細胞因子等參與膠原重建[5]。

因為肥大細胞是急性炎癥的敏感性指標，本研究中我們評估了激光治療后1h和1天處于創(chuàng)傷愈合炎癥期的肥大細胞變化。通過甲苯胺藍特殊染色，我們發(fā)現(xiàn)肥大細胞總數(shù)在該期明顯增加，提示激光照射可促進肥大細胞在真皮募集和浸潤。關于脫顆粒的肥大細胞，在治療組亦可見脫顆粒的肥大細胞較正常對照組明顯升高，提示真皮肥大細胞參與急性炎癥過程，原因是肥大細胞脫顆粒后預形成的介質通過多種作用而促進炎癥的發(fā)生。

關于增生期和重建期，我們的研究表明治療組肥大細胞總數(shù)在21～60天較正常對照組明顯增高，治療組脫顆粒的肥大細胞數(shù)量在7～60天較正常對照組明顯增高，此結果是排除了急性炎癥的影響而獲得的，因為第3次和第4次取材是發(fā)生在相應的第3次和第4次治療前。因此可以推測肥大細胞增多與創(chuàng)傷愈合增生期和重建期有關。

成纖維細胞增生是增生期的特征性表現(xiàn)，大量實驗表明肥大細胞脫顆?？烧T導成纖維細胞增生[10-12]。肥大細胞可釋放特異性促進成纖維細胞增生活性的物質，如組胺、類胰蛋白酶、白細胞介素(interleukin， IL)-1， IL-4 和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor ， TNF)等細胞因子及轉化生長因子(transforming growth factor， TGF)和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor， bFGF)等生長因子[11-16]，這些介質可刺激成纖維細胞趨化、遷移、分化和生物合成活性。此外，肥大細胞與成纖維細胞毗鄰，兩種細胞之間存在縫隙連接，使兩種細胞直接相互聯(lián)系和功能上具有協(xié)同作用。通過HE染色，我們檢測了激光治療過程中成纖維細胞數(shù)量的變化，發(fā)現(xiàn)在7天至60天治療組成纖維細胞數(shù)量較正常對照組明顯增高。同時發(fā)現(xiàn)成纖維細胞與脫顆粒的肥大細胞的數(shù)量呈顯著正相關。這些結果提示肥大細胞可能參與非剝脫性激光引起的成纖維細胞增生。

在重建期，肥大細胞脫顆粒在膠原的沉積和生成方面也起重要作用。在肥大細胞顆粒成分中，類胰蛋白酶能增強成纖維細胞I型膠原mRNA的表達[17]。最近的證據(jù)表明皮膚肥大細胞和類糜蛋白酶在創(chuàng)傷愈合過程中膠原纖維的合成方面起重要作用[18]。除類胰蛋白酶和類糜蛋白酶，多功能細胞因子如TGF， bFGF、IL-4和TNF也是潛在的刺激成纖維細胞細胞外基質合成和增加膠原生成的重要介質。關于本研究中的膠原重建，我們發(fā)現(xiàn)治療組I型膠原在21～60天，III型膠原在7～60天較正常對照組明顯升高。進而探討真皮I型、III型膠原水平與脫顆粒的肥大細胞的相關性，我們發(fā)現(xiàn)真皮I型和III型膠原水平分別與脫顆粒的肥大細胞數(shù)量呈顯著正相關。因此推測肥大細胞可能參與非剝脫性激光誘導的熱創(chuàng)傷修復過程中的真皮膠原重建。

本研究中我們檢測了非剝脫性激光引起的組織學改變以探討其嫩膚的即時和長期機制。我們的結果表明非剝脫性激光誘導的熱創(chuàng)傷在治療組皮膚較正常對照組皮膚可激活更多的肥大細胞。當前的研究揭示真皮肥大細胞可能參與非剝脫性激光誘導的炎癥反應、成纖維細胞增生和膠原重建。

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[收稿日期]2010-02-25 [修回日期]2010-04-10

編輯/張惠娟

注:本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文