摘 要：以中國李Nubiana試管苗幼嫩葉片上的葉柄為試材，研究了基本培養(yǎng)基、激素種類配比、暗培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基中瓊脂濃度等對(duì)葉柄再生的影響，建立了其葉柄再生體系。結(jié)果表明，中國李Nubiana葉柄再生不定芽最佳培養(yǎng)基為WPM+TDZ0.5mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+瓊脂6g·L^-1，不定芽再生率可達(dá)到35.0％；暗培養(yǎng)為葉柄不定芽再生的必要條件，暗培養(yǎng)14d后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)，能促進(jìn)葉柄產(chǎn)生不定芽。中國李Nubiana葉柄再生表現(xiàn)出明顯的極性，不定芽一般出現(xiàn)在葉柄的近軸端。

關(guān)鍵詞：中國李；Nubiana；葉柄；離體培養(yǎng)

中圖分類號(hào)：S662.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1009-9980(2010)05-708-05

建立穩(wěn)定高效的離體再生技術(shù)體系成為開展核果類果樹遺傳轉(zhuǎn)化研究的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，但薔薇科李屬植物離體再生困難，長期以來一直是果樹生物技術(shù)研究的難點(diǎn)。國內(nèi)外有關(guān)核果類果樹桃、櫻桃、杏_句等的葉片、葉柄植株再生培養(yǎng)研究報(bào)道較多，但有關(guān)李的研究相對(duì)較少。Barhara等分別在2004、2007年對(duì)影響歐洲李葉片植株再生的激素種類及濃度、碳源、氮源等因素進(jìn)行研究，并得到了較適合歐洲李(Prunus domestica)葉片再生的培養(yǎng)基配方：劉崇琪等采用新疆野生櫻桃李(件unuscerasifera)無菌試管苗葉片為試材得到再生植株；許建蘭等采用Damasl869李離體葉片為試材獲得再生植株，不定芽再生率為73.5％。在相關(guān)李屬植物葉片再生體系中，尚未見中國李葉柄再生不定芽的研究報(bào)道。樊青峰等以中國李Nubiana葉片為試材。對(duì)其愈傷組織的誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)及褐變調(diào)控進(jìn)行了研究，誘導(dǎo)出愈傷組織，但愈傷組織未能分化形成不定芽?；诖耍覀円灾袊頝ubiana試管苗幼嫩葉片上的葉柄為試材，研究了再生基本培養(yǎng)基、激素配比、暗培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基中瓊脂濃度等對(duì)離體葉柄再生的影響，以期建立穩(wěn)定高效的葉柄再生體系，為進(jìn)一步開展中國李遺傳轉(zhuǎn)化研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為中國李Nubiana(Prunus salcina)試管苗，30 d左右繼代1次；繼代培養(yǎng)基：LP+IBA0.06mg·L^-1+6-BA 0.4mg·LL^-1+3g·L^-1。蔗糖+7g·LL^-1。瓊脂，pH值為5.90-6.00。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) (1)再生培養(yǎng)基：采用WPM、LP、MS 3種不同類型的基本培養(yǎng)基；(2)激素配比：細(xì)胞分裂素用TDZ，生長素用2，4-D從不同濃度范圍進(jìn)行組合；(3)暗培養(yǎng)時(shí)間：設(shè)計(jì)不同暗培養(yǎng)時(shí)間O、7、14、21、28 d；(4)瓊脂濃度：設(shè)計(jì)4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 g·L^-1等幾種瓊脂濃度。

1.2.2 再生培養(yǎng) 繼代培養(yǎng)3周左右生長健壯的無菌試管苗，取上部較嫩的2～5枚展開葉片的葉柄，接種在各誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。再生培養(yǎng)基除特殊說明外一般用WPM+TDZ0.5 mg·L^-1蔗糖30g·L^-1+瓊脂6g·L^-11，pH值為5.90～6.00，除TDZ為過濾滅菌之后加入外，其他成分均在高壓滅菌前加入。

1.2.3 生根培養(yǎng) 離體葉柄誘導(dǎo)再生苗長到1.5cm左右轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)方法同前述1.1試管苗的培養(yǎng))，繼代培養(yǎng)1-2次后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根。生根培養(yǎng)基配方為1/2MS+IBA0.5mg·L^-1。

1.2.4 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)室溫度為(25±2)℃，光照強(qiáng)度2000-3000lx，光照周期16h光照/8h黑暗。葉柄誘導(dǎo)不定芽，暗培養(yǎng)14d后光下培養(yǎng)0。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 每個(gè)試驗(yàn)處理接種20個(gè)外植體，重復(fù)3次。葉柄接種于再生培養(yǎng)基后對(duì)葉柄再生不定芽的形態(tài)分化過程進(jìn)行觀察，并在35d對(duì)不定芽再生率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SAS軟件(8.1版本)的ANOVA程序進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不定芽的發(fā)生

接種到培養(yǎng)基上5～7d，葉柄近軸端切口處略微膨大變白；13～15d，在葉柄的近軸端出現(xiàn)微量愈傷組織并可觀察到芽點(diǎn)；21-30d，芽點(diǎn)逐漸長大伸長：30-45d前期未分化的愈傷組織不再有不定芽的出現(xiàn)(圖版A-F)。不定芽全部出現(xiàn)在葉柄的近軸端，表現(xiàn)出明顯的極性效應(yīng)(圖版E)。

2.2基本培養(yǎng)基對(duì)中國李Nubiana離體葉柄誘導(dǎo)不定芽的影響

葉柄在3種基本培養(yǎng)基上再生率差異較顯著。在WPM培養(yǎng)基上，不定芽再生率達(dá)到最高28.3％，且不定芽生長健壯；LP培養(yǎng)基上，不定芽再生率為20.0％，生長較正常，但出現(xiàn)少量玻璃化現(xiàn)象，不利于之后不定芽的增殖和生根。MS培養(yǎng)基上不定芽再生率僅為11.7％，且不定芽發(fā)生時(shí)間較WPM和LP培養(yǎng)基晚3d(表1)。

2.3 激素對(duì)中國李Nubiana離體葉柄誘導(dǎo)不定芽的影響

由表2可知，當(dāng)只添加TDZ 0.5mg·L^-1時(shí)，葉柄再生不定芽效果最好，再生率可達(dá)28.3％，且不定芽生長健壯。當(dāng)只添加TDZ 1.0 mg·L^-1。時(shí)，葉柄不定芽再生率雖然可達(dá)31.7％，但出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。不利于之后不定芽的增殖和生根。從處理1-5不定芽的再生率及生長狀態(tài)可以看出，隨著TDZ濃度的增加，不定芽的再生率先增加后降低，且不定芽隨著TDZ濃度的增加出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象并逐漸加重。在25個(gè)處理中，隨著2，4-D濃度的增加，不定芽的再生率逐漸下降。當(dāng)2，4-D濃度為0mg·L^-1時(shí)，葉柄不定芽的再生率達(dá)到最高；而當(dāng)2，4-D濃度達(dá)到0.8mg·L^-1。時(shí)，葉柄不能再生不定芽，說明2，4-D對(duì)中國李葉柄不定芽的再生有抑制作用。

2.4 暗培養(yǎng)時(shí)間對(duì)中國李Nubiana離體葉柄誘導(dǎo)不定芽的影響

將葉柄接種在誘導(dǎo)不定芽再生的適宜培養(yǎng)基WMP+TDZ0.5mg·L^-1上，發(fā)現(xiàn)暗培養(yǎng)時(shí)間對(duì)不定芽再生影響顯著。葉柄經(jīng)過14 d暗培養(yǎng)后再轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)明顯促進(jìn)不定芽的再生，再生率為30.0％，且不定芽生長健壯；而未經(jīng)過暗培養(yǎng)的葉柄短時(shí)間內(nèi)全部褐變，再生率為0(表3)。

2.5 瓊脂濃度對(duì)中國李Nubiana離體葉柄誘導(dǎo)不定芽的影響

瓊脂濃度對(duì)中國李Nubiana離體葉柄誘導(dǎo)不定芽的再生率影響并不顯著，但對(duì)植株的生長狀態(tài)影響較為明顯。同樣接種在WMP+TDZ 0.5mg·L^-1。固體培養(yǎng)基上，當(dāng)瓊脂濃度為6g·L^-1時(shí)，不定芽的再生率為35.0％，且不定芽生長健壯。隨著瓊脂濃度的降低，不定芽易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象；而瓊脂濃度增加，培養(yǎng)基固化程度較重，不定芽發(fā)生時(shí)間延后(表4)。

2.6 不定芽的增殖、生根和成苗

當(dāng)不定芽生長到1.5cm長的時(shí)候，將不定芽從葉柄上分離后繼代培養(yǎng)1-2次。從繼代培養(yǎng)的試管苗中選取長約1.5cm的帶有2-3片葉的新梢，接種到生根培養(yǎng)基上。接種后暗培養(yǎng)7d，然后移至光下培養(yǎng)。2-3周試管苗生根，生根率在85％以上，每株生根3-4條。之后煉苗1周就可移栽進(jìn)營養(yǎng)缽中繼-續(xù)生長培養(yǎng)(圖版-G~I)。

3 討論

3.1 基本培養(yǎng)基對(duì)中國李Nubiana離體葉柄誘導(dǎo)不定芽的影響

目前，核果類果樹中應(yīng)用比較廣泛的是MS培養(yǎng)基，但也有試驗(yàn)表明F14培養(yǎng)基更適合核果類果樹組織培養(yǎng)。Fasolo等引認(rèn)為，低鹽培養(yǎng)基比高鹽培養(yǎng)基效果更好，尤其是較低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的N素對(duì)以葉片為主的外植體不定芽再生效果較好。Barbara等指出，歐洲李葉片在含氮量等同于1/2MS總氮量的培養(yǎng)基上再生率顯著高于MS培養(yǎng)基。本實(shí)驗(yàn)比較了WPM、MS、12等基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)中國李葉柄不定芽再生的效果，發(fā)現(xiàn)WPM培養(yǎng)基對(duì)中國李效果最好，新梢生長正常，LP次之，MS最差。這與櫻桃葉片再生、中國李葉片愈傷組織誘導(dǎo)、櫻桃李葉片再生等研究中得到的結(jié)論相同。這可能是因?yàn)閃PM培養(yǎng)基中各類礦物質(zhì)成分偏低，N含量低，Ca含量高，屬于低氮、低鹽培養(yǎng)基，更有利于李屬植物的生長。

3.2 植物激素濃度配比對(duì)中國李Nubiana離體葉柄誘導(dǎo)不定芽的影響

植物激素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)、器官分化起著重要作用，是影響物質(zhì)形態(tài)建成的主要因子。當(dāng)生長素與細(xì)胞分裂素比值低時(shí)有利于長芽，比值高時(shí)有利于長根，中間比值有利于愈傷組織的誘導(dǎo)和分化。TDZ作為一種細(xì)胞分裂素，對(duì)木本植物的離體芽增殖具有顯著的促進(jìn)作用。近年來，TDZ廣泛應(yīng)用于核果類果樹葉片培養(yǎng)，Mante等用5-12.5umTDZ誘導(dǎo)歐洲李子葉，獲得了再生芽。Barbara等研究表明，適宜濃度的TDZ可以促進(jìn)葉片產(chǎn)生大量的愈傷組織及不定芽，而BAP只能使葉片產(chǎn)生少量的愈傷組織和單一的芽。Canli等單獨(dú)使用TDZ誘導(dǎo)日本李子葉，獲得了再生芽，同時(shí)指出TDZ誘導(dǎo)不定芽的效果優(yōu)于6-BA。本試驗(yàn)中，TDZ對(duì)葉柄再生起到了很好的效果，但隨著TDZ濃度增高，玻璃化和簇狀苗現(xiàn)象增多，這可能是由于它極高的細(xì)胞分裂素活性造成的。因此適當(dāng)?shù)奶砑覶DZ，有利于中國李Nubiana葉柄不定芽的發(fā)生。

3.3 暗培養(yǎng)時(shí)間對(duì)中國李Nubiana離體葉柄誘導(dǎo)不定芽的影響

大量研究顯示，光照條件是影響植株不定芽再生的重要因素之一。Liu等認(rèn)為接種后最初的暗培養(yǎng)是再生過程所必需的，而且光照的抑制作用不可逆轉(zhuǎn)。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，不經(jīng)過暗培養(yǎng)的葉柄不能再生不定芽，最佳的暗培養(yǎng)時(shí)間為14d。這與歐洲李、野生櫻桃李上的研究結(jié)果相似，但由于試驗(yàn)材料基因型的不同，最佳暗培養(yǎng)時(shí)間也有所不同。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，暗培養(yǎng)時(shí)間的長短對(duì)不定芽的發(fā)生有顯著影響。暗培養(yǎng)時(shí)間短，不能啟動(dòng)葉柄不定芽的發(fā)生；而暗培養(yǎng)時(shí)間長，所發(fā)生的不定芽因得不到光照白化死亡，愈傷組織大量生長，且不再具有分化能力。因此，適宜的暗培養(yǎng)時(shí)間有利于中國李Nubiana不定芽的發(fā)生。

樊青峰等利用中國李Nubiana葉片誘導(dǎo)出愈傷組織，但所得愈傷組織未進(jìn)一步分化形成再生植株。本試驗(yàn)以中國李Nubiana葉柄為外植體，誘導(dǎo)出愈傷組織進(jìn)而產(chǎn)生不定芽，但再生率不高，仍需進(jìn)一步提高，以期滿足中國李遺傳轉(zhuǎn)化對(duì)再生體系的要求。

4 結(jié)論

中國李Nubiana葉柄再生不定芽最佳培養(yǎng)基為WPM+TDZ0.5mgL^-1+蔗糖30g·L^-1+瓊脂6g·L^-1，不定芽再生率可達(dá)到35，0％。暗培養(yǎng)是中國李Nu。biana葉柄再生的必要條件。在最佳培養(yǎng)基上，葉柄暗培養(yǎng)14 d，不定芽的再生率最高。