崔楠 鄒大進(jìn)

胰淀粉樣多肽在糖尿病及胰腺癌患者胰腺組織中的表達(dá)

崔楠 鄒大進(jìn)

目的檢測(cè)胰淀粉樣多肽(IAPP)在胰腺癌患者胰腺組織中的表達(dá),探討胰腺癌與糖尿病的相關(guān)性。方法收集28例手術(shù)切除的胰腺癌及其相應(yīng)癌旁正常胰腺組織，其中12例患者合并糖尿病，16例不合并糖尿病。采用免疫組化和蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)檢測(cè)組織標(biāo)本中IAPP的表達(dá)。結(jié)果IAPP定位表達(dá)于人胰腺的胰島細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)。合并糖尿病的胰腺癌組織及癌旁胰腺組織、不合并糖尿病的胰腺癌組織及癌旁胰腺組織IAPP表達(dá)的免疫組化指數(shù)分別為283 305±91 627、122 874±86 917、154 032±81 097和105 797±67 593；IAPP相對(duì)表達(dá)量分別為(173.1±23.5)%、(119.4±18.4)%、(148.7±28.3)%和100%。胰腺癌組織的IAPP表達(dá)均顯著高于相應(yīng)癌旁正常胰腺組織(Plt;0.01)；合并糖尿病的胰腺癌組織的IAPP表達(dá)顯著高于不合并糖尿病的胰腺癌組織(Plt;0.01)；合并糖尿病的癌旁胰腺組織的IAPP表達(dá)高于不合并糖尿病的癌旁胰腺組織(Plt;0.05) 。結(jié)論IAPP 與糖尿病及胰腺癌的發(fā)病密切相關(guān)，很可能為兩種疾病的共同發(fā)病機(jī)制之一。

胰腺腫瘤； 糖尿病，2型； 胰淀粉樣多肽； 免疫組織化學(xué)； 印跡法，蛋白質(zhì)

胰島淀粉樣多肽 (islet amyloid polypeptide，IAPP)，又稱胰淀素(amylin),是進(jìn)食后同胰島素一起由胰島β細(xì)胞分泌的肽類激素，是胰島淀粉樣蛋白沉積的主要和獨(dú)特成分。尸檢證實(shí)，50%～90%的2型糖尿病患者可發(fā)生胰島淀粉樣病變[1,2]。在2型糖尿病的猴子和貓的動(dòng)物模型中，也發(fā)現(xiàn)了胰島淀粉樣病變[3,4]，但在小鼠和大鼠中則無此現(xiàn)象，表明胰島淀粉樣病變與動(dòng)物種屬有關(guān)。也有研究表明[5]，合并糖尿病的胰腺癌患者血漿IAPP的濃度明顯高于正常人及其他腫瘤患者，但I(xiàn)APP在人胰腺組織及胰腺癌組織中的表達(dá)鮮見報(bào)道。因此，我們檢測(cè)IAPP在胰腺癌組織和癌旁胰腺組織中的表達(dá)及其與血糖的關(guān)系，探討IAPP在胰腺癌合并糖尿病發(fā)生中的作用。

材料與方法

一、組織標(biāo)本

所有標(biāo)本均取自2006年10月至2007年5月第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院普外科手術(shù)切除的28例胰腺癌組織及相應(yīng)癌旁正常胰腺組織，標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)確診,均有完整的手術(shù)記錄資料及臨床資料，所有患者均術(shù)前簽署知情同意書。12例患者合并糖尿病(符合1999年WHO 2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn))，16例患者血糖正常。分為合并糖尿病的胰腺癌組織、合并糖尿病的癌旁胰腺組織、不合并糖尿病的胰腺癌組織及不合并糖尿病的癌旁胰腺組織4組。

二、IAPP檢測(cè)

采用ABC法檢測(cè)。兔抗人Amylin單克隆抗體(Serotec公司)1∶100稀釋，生物素標(biāo)記二抗及辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素相繼室溫孵育后DAB顯色。應(yīng)用MIQAS醫(yī)學(xué)圖像定量分析系統(tǒng)、 醫(yī)學(xué)圖像定量分析軟件分析視野中陽(yáng)性區(qū)域面積以及光密度(A)值，兩者乘積為免疫組化指數(shù)。每張切片分析3個(gè)視野。

同時(shí)采用蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)半定量測(cè)定IAPP的表達(dá)。新鮮胰腺癌及癌旁正常胰腺組織制備勻漿，12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，按Amersham Phamacia公司Hybond ECL操作說明進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。加入兔抗人Amylin多克隆抗體(Abcam公司)和辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶25 000稀釋)，最后ECL發(fā)光。用Quantity One圖像分析軟件(Bio-Rad)灰度掃描X線膠片。以β-actin作為內(nèi)參照，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量以目的蛋白與β-actin灰度值之比表示。將不合并糖尿病的癌旁正常胰腺組織的目的條帶相對(duì)表達(dá)量設(shè)為100%，計(jì)算其他各組與其的比值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、一般臨床資料

12例合并糖尿病的胰腺癌患者，糖尿病史(2.1±0.8)年，HbA1c 8.36±2.4，其中男8例，女4例，年齡(59±8)歲，體重指數(shù)(23.6±3.1)kg/m2，收縮壓(129±16)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，舒張壓(84±8)mm/Hg，三酰甘油(1.42±0.53)mmol/L；16例不合并糖尿病的胰腺癌患者，男6例，女10例，年齡(59±6)歲，體重指數(shù)(22.9±2.9)kg/m2，收縮壓(125±17)mmHg，舒張壓(78±9)mmHg，三酰甘油(1.23±0.36)mmol/L。兩組間無顯著差異。

二、IAPP在胰腺組織中的表達(dá)

免疫組化染色顯示，胰腺癌及其癌旁正常胰腺組織中的胰島細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見棕黃色陽(yáng)性顆粒，而非胰島細(xì)胞區(qū)域未見明顯陽(yáng)性深染區(qū)，不合并糖尿病的癌旁胰腺組織中的胰島的染色程度明顯弱于其他3組(圖1)。合并糖尿病的胰腺癌組織、癌旁胰腺組織、不合并糖尿病的胰腺癌組織及癌旁胰腺組織的免疫組化陽(yáng)性指數(shù)分別為283 305±91 627、122 874±86 917、154 032±81 097和105 797±67 593。不管是否合并糖尿病，胰腺癌組織的免疫組化指數(shù)均顯著高于相應(yīng)癌旁正常胰腺組織(Plt;0.01)；合并糖尿病的胰腺癌組織的免疫組化指數(shù)顯著大于不合并糖尿病的胰腺癌組織；而癌旁胰腺組織間的免疫組化指數(shù)無顯著差異。

Western blotting檢測(cè)與免疫組化結(jié)果一致(圖2)。合并糖尿病的胰腺癌組織及其癌旁胰腺組織、不合并糖尿病的胰腺癌組織及其癌旁胰腺組織的IAPP相對(duì)表達(dá)量分別為(173.1±23.5)%、(119.4±18.4)%、(148.7±28.3)%和100%，不管是否合并糖尿病，胰腺癌組織的IAPP相對(duì)表達(dá)量均顯著高于相應(yīng)癌旁正常胰腺組織(Plt;0.01)；合并糖尿病的胰腺癌組織的IAPP相對(duì)表達(dá)量顯著大于不合并糖尿病的胰腺癌組織(Plt;0.01)；合并糖尿病的癌旁胰腺組織的IAPP相對(duì)表達(dá)量顯著大于不合并糖尿病的癌旁胰腺組織(Plt;0.05)。

圖1合并糖尿病的胰腺癌組織(A)、合并糖尿病的癌旁胰腺組織(B)、不合并糖尿病的胰腺癌組織(C)及不合并糖尿病的癌旁胰腺組織(D)的IAPP表達(dá)(免疫組化 ×400)

圖2合并糖尿病的胰腺癌組織(A)、合并糖尿病的癌旁胰腺組織(B)、不合并糖尿病的胰腺癌組織(C)及不合并糖尿病的癌旁胰腺組織(D)的IAPP表達(dá)(Western blotting)

討 論

早在20世紀(jì)70年代就有研究顯示，80%的胰腺癌患者確診時(shí)已經(jīng)發(fā)生了2型糖尿病或糖耐量異常[6],其后也有多項(xiàng)研究證實(shí)，胰腺癌與糖尿病及糖耐量異常密切相關(guān)[7]。1995年發(fā)表的納入20個(gè)臨床研究的薈萃分析顯示，病程在5年以上的糖尿病患者中，胰腺癌的發(fā)病危險(xiǎn)高于正常人群的2倍[8]，近年來發(fā)表的納入50多個(gè)臨床研究的多個(gè)薈萃分析也得出了相同的結(jié)論[9-10]。盡管多項(xiàng)流行病學(xué)資料顯示糖尿病和胰腺癌有密切的相關(guān)性，但是使二者密切相關(guān)的因素及機(jī)制目前還不十分清楚。

以IAPP為主要成分的胰島淀粉樣蛋白沉積是2型糖尿病的一個(gè)典型病理特征。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),猴和貓的自發(fā)性糖尿病模型胰腺體內(nèi)都能形成胰島淀粉樣蛋白沉積,這些動(dòng)物模型具有與人類2型糖尿病相似的癥狀,如發(fā)病年齡相對(duì)較大,伴有肥胖,由糖耐量異常發(fā)展為高血糖狀態(tài),最終依賴胰島素治療。Wang 等[11]通過對(duì)高表達(dá)hIAPP的轉(zhuǎn)基因小鼠研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)80%的β細(xì)胞不同程度受累時(shí),約1.5%的β細(xì)胞被淀粉樣沉積物代替,而當(dāng)所有的細(xì)胞均受累時(shí),約有10%的細(xì)胞被沉積物取代,此時(shí),轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出輕度胰島素分泌功能受損,空腹血糖仍在正常范圍。隨著更多的β細(xì)胞被淀粉樣沉積物取代,小鼠的血糖逐漸升高直至必須依賴胰島素治療。表明胰島淀粉樣蛋白沉積破壞了胰島β細(xì)胞,造成β細(xì)胞功能受損，發(fā)生糖耐量異常進(jìn)而導(dǎo)致糖尿病,因此,動(dòng)物的胰島淀粉樣沉積可視為糖耐量異常和糖尿病的原因。

人類胰島淀粉樣蛋白沉積與糖耐量的關(guān)系比動(dòng)物復(fù)雜得多,由于胰島淀粉樣蛋白沉積必須通過病理檢查才能證實(shí),這在人類很難做到?，F(xiàn)有的尸體解剖雖然發(fā)現(xiàn)76%～90%的2 型糖尿病患者存在胰島淀粉樣蛋白沉積,而非糖尿病者只有0～50%發(fā)生胰島淀粉樣蛋白沉積[12-15],但是2 型糖尿病患者胰島淀粉樣蛋白沉積的輕重程度有很大差異,受累的胰島β細(xì)胞范圍為lt;1%～gt;80%,單個(gè)β細(xì)胞淀粉樣變的嚴(yán)重程度差別也非常大。

許多研究表明，IAPP與胰腺癌及糖尿病的發(fā)病密切相關(guān)。Ding等[16]將β細(xì)胞暴露于胰腺癌細(xì)胞條件培養(yǎng)液中可以選擇性地刺激β細(xì)胞分泌IAPP。Permert 等[5]研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌合并糖尿病的患者血漿IAPP濃度明顯高于非腫瘤人群及血糖正常人群，而胰腺癌組織中IAPP的表達(dá)水平低于癌旁胰腺組織以及正常胰腺組織，癌旁胰腺組織的胰島B細(xì)胞IAPP表達(dá)也明顯減少，作者認(rèn)為IAPP在B細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生但并沒有正常地儲(chǔ)存，這可能是外周血IAPP濃度升高的原因。他們[17]又通過導(dǎo)管細(xì)胞專一致癌物BOP誘導(dǎo)敘利亞金倉(cāng)鼠發(fā)生胰腺癌，誘導(dǎo)后12周的血漿胰高糖素水平明顯升高，誘導(dǎo)27周后，血漿胰島素水平及IAPP水平明顯升高，而胰腺組織IAPP濃度卻明顯降低，只有對(duì)照組的44%，進(jìn)一步證實(shí)上述觀點(diǎn)。

M?kimattila等[18]報(bào)道，血糖正常的胰腺癌患者的血漿IAPP水平明顯升高，而合并糖尿病的胰腺癌患者IAPP水平降低，從而認(rèn)為IAPP與胰島素的比值增高可以作為一個(gè)預(yù)測(cè)血糖正常的患者發(fā)生胰腺癌的檢測(cè)因子。Chari等[19]報(bào)道，胰腺癌患者血漿IAPP濃度明顯高于非胰腺癌患者，而且合并糖尿病者血漿IAPP濃度增高更加明顯。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，胰腺癌組織及癌旁胰腺組織的胰島細(xì)胞均有IAPP的表達(dá)，癌組織IAPP的表達(dá)強(qiáng)于癌旁胰腺組織；合并糖尿病者的表達(dá)強(qiáng)于不合并糖尿病者，與Permert等[5]的結(jié)論不一致。Katsumichi等[20]檢測(cè)正常人胰腺、糖尿病胰腺組織、胰腺癌組織及癌旁胰腺組織IAPP的表達(dá)，結(jié)果在胰腺癌組織的胰島細(xì)胞中并未發(fā)現(xiàn)胰島淀粉樣變，而糖尿病患者的胰島內(nèi)均存在不同程度的淀粉樣變，結(jié)果也不一致。分析原因可能與種族差異有關(guān)，但需要進(jìn)一步證實(shí)。

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2008-08-11)

(本文編輯：屠振興)

Expressionofisletamyloidpolypeptideinpancreasofpatientswithdiabetrsandpancreaticcancer

CUINan,ZHOUDa-jin.

DepartmentofEndocrine,ChanghaiHospital,SecondMillitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

ObjectiveTo detect the expression of islet amyloid polypeptide (IAPP) in the pancreatic tissues of patients with pancreatic cancer, and to explore the relation between diabetes and pancreatic cancer.MethodsSurgically-removed 28 pancreatic cancer samples and adjacent normal pancreatic tissues were studied. Among these patients there were 12 patients complicated with diabetes while other 16 patients did not. Immunohistochemical method and Western blot method were used to detect the expression of IAPP in different tissue specimens.ResultsIAPP expressed in human pancreatic islet cell cytoplasm. Immunohistochemical index of pancreatic cancer and adjacent normal pancreatic specimens of patients with diabetes, and pancreatic cancer and adjacent normal pancreatic specimens of patients without diabetes were 283 305±91 627, 122 874±86 917, 154 032±81 097 and 105 797±67 593, respectively; the relative IAPP expressions were (173.1±23.5)%, (119.4±18.4)%, (148.7±28.3)% and 100%. Irrespective of the presence of diabetes, expression of IAPP in pancreatic cancer specimens was significantly higher than that in adjacent normal pancreatic specimens (Plt;0.01); expression of IAPP in pancreatic cancer plus diabetes specimens was significantly higher than that in pancreatic cancer specimens without diabetes (Plt;0.01); expression of IAPP in adjacent pancreatic specimens complicated with diabetes was significantly higher than that in adjacent pancreatic specimens without diabetes (Plt;0.05).ConclusionsIAPP participated in the course of diabetes and pancreatic cancer, and may be the common pathogenesis of the two diseases.

Pancreatic neoplasms; Diabetes mellitus, type 2; Islet amyloid polypeptide; Immunohistochemistry; Boltting, western

Correspondintauthor:ZHOUDa-jin,Email:zwdj22@medmail.com.cn

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.02.015

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院內(nèi)分泌科

鄒大進(jìn)，Email: zwdj22@medmail.com.cn