朱華 許春芳 葉建新

褪黑素對(duì)胰腺癌細(xì)胞株SW1990體外增殖及凋亡的影響

朱華 許春芳 葉建新

目的探討褪黑素(MT)體外抑制胰腺癌細(xì)胞株SW1990增殖及誘導(dǎo)其凋亡的作用。方法以不同濃度的MT(0.1、0.5、1.0、2.5及5.0 mmol/L)處理體外培養(yǎng)的胰腺癌細(xì)胞株SW1990細(xì)胞24、48、72 h。用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖，以AnnexinⅤ/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期及Western blotting檢測(cè)細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)。結(jié)果MT呈濃度和時(shí)間依賴性抑制SW1990細(xì)胞的增殖。0.1～5.0 mmol/L MT作用48 h后，細(xì)胞的增殖抑制率為7.4%～85.8%。1.0～5.0 mmol/L MT作用48 h后，G0/G1期比例為72.6%～85.3%，細(xì)胞凋亡率為21.5%～41.7%，同時(shí)Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，Bcl-2/Bax比值下降。結(jié)論MT可以抑制SW1990細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與上調(diào)Bax表達(dá)，下調(diào)Bcl-2表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，將細(xì)胞周期阻止于G0/G1期有關(guān)。

胰腺腫瘤； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞凋亡； 褪黑素

胰腺癌是一種預(yù)后極差的惡性腫瘤,70%～80%的患者診斷時(shí)已屬晚期失去手術(shù)時(shí)機(jī)，而化療藥物療效卻不盡人意，因此，尋找一種高效低毒的化療藥物仍是眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn)之一。褪黑素(melatonin,MT)是松果腺分泌的一種吲哚類激素，其作為一種天然的抗腫瘤藥物，已被眾多研究者關(guān)注。本研究探討褪黑素在體外對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株SW1990細(xì)胞增殖及凋亡的影響,探討其抗腫瘤的可能機(jī)制。

材料和方法

一、細(xì)胞株、藥物及主要試劑

人胰腺癌細(xì)胞株SW1990購(gòu)自蘇州大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院血液研究所，常規(guī)培養(yǎng)及傳代；MT及噻唑鹽(MTT)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO公司；抗bcl-2和bax一抗購(gòu)自SantaCruz公司，二抗購(gòu)自中杉金橋。

二、細(xì)胞增殖檢測(cè)

采用MTT法。將SW1990細(xì)胞按每孔4×103個(gè)接種于96孔板,常規(guī)培養(yǎng)24 h后,分別加入終濃度為0.1、0.5、1.0、2.5及5.0 mmol/L的MT繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后,分別加入5 mg/ml的MTT 20 μl輕輕晃勻,37℃溫育4 h,去除培養(yǎng)液后,每孔加入DMSO 100 μl,振蕩混勻10 min,應(yīng)用BIOLISA酶標(biāo)儀測(cè)各孔A492值。每一濃度設(shè)5復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

三、細(xì)胞周期及凋亡檢測(cè)

用1.0、2.5及5.0 mmol/L的MT作用SW1990細(xì)胞48 h，EDTA消化收獲細(xì)胞后70%乙醇固定過夜,相應(yīng)處理后加入PI 500 μl，上BIOLISA流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期；另收集細(xì)胞，2 000 g離心5 min，PBS洗滌2次后加入Binding Buffer 500 μl、AnnexinV(FITC)5 μl，混勻后加入PI 5 μl，室溫避光反應(yīng)5～15 min，于流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

四、Bcl-2及Bax蛋白檢測(cè)

取上述各組5×105個(gè)細(xì)胞,加入5倍體積的細(xì)胞裂解液孵育20 min。測(cè)蛋白濃度，取40 μg常規(guī)行Western blotting，最后ECL發(fā)光，X線曝光、顯影和定影。條帶進(jìn)行吸光度掃描分析,并與對(duì)照組結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、胰腺癌細(xì)胞增殖的變化

MT以濃度依賴性地抑制胰腺癌細(xì)胞株SW1990細(xì)胞的生長(zhǎng)，且隨濃度的增加抑制作用增強(qiáng)。MT 0.1、0.5 mmol/L各時(shí)間點(diǎn)組及MT 1.0 mmol/L、24 h組與對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，1.0 mmol/L 48、72 h組及2.5、5.0 mmol/L各時(shí)間點(diǎn)組與對(duì)照組比較，差異均有顯著性(P﹤0.05或0.01，圖1)。

與對(duì)照組比較，★Plt;0.05,▼Plt;0.01

二、細(xì)胞周期改變

經(jīng)MT處理后，SW1990細(xì)胞G0/G1期增多，S期和G2/M期減少(表1)。

表1 不同濃度MT對(duì)SW1990細(xì)胞周期的影響

注：與對(duì)照組比較，*Plt;0.05

三、細(xì)胞凋亡率改變

MT 1.0、2.5、5.0 mmol/L處理SW1990細(xì)胞48 h后，細(xì)胞的凋亡率分別為21.5%、34.3%和41.7%(圖2)。

圖2 各組SW1990細(xì)胞的流式細(xì)胞儀檢測(cè)圖

四、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的變化

MT處理SW1990細(xì)胞48 h后，Bax表達(dá)增強(qiáng)，而Bcl-2表達(dá)降低，差異有顯著性(Plt;0.05，圖3)。

圖3 各組SW1990 細(xì)胞的Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)

討 論

大量體外實(shí)驗(yàn)顯示，MT對(duì)多種良惡性腫瘤細(xì)胞，如乳腺癌MCF-7細(xì)胞株、惡性黑色素瘤B7、S9細(xì)胞株等均有顯著的生長(zhǎng)抑制作用，并具有濃度依賴性。但MT的作用可表現(xiàn)為雙向性，在微摩爾濃度時(shí)可刺激細(xì)胞增殖,在毫摩爾濃度時(shí)則表現(xiàn)為抑制作用，即抑制細(xì)胞增殖、增加凋亡細(xì)胞數(shù)及阻礙細(xì)胞周期的正常運(yùn)行[1]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MT呈濃度、時(shí)間依賴性抑制SW1990細(xì)胞的增殖，瘤細(xì)胞周期明顯地被阻止于G1期，并使S期細(xì)胞比例減少，這與Shiu等[2]的結(jié)果相吻合。

在細(xì)胞凋亡早期,往往是在細(xì)胞膜上發(fā)生變化[3-4]。其中胞膜的一個(gè)改變是磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS)從胞膜內(nèi)易位到胞膜外，暴露在細(xì)胞表面。AnnexinV是Ca2+依賴性脂結(jié)合蛋白,與PS具高度親和性。雖然壞死細(xì)胞亦可出現(xiàn)此類表現(xiàn),但由于同時(shí)結(jié)合PI染色,因此可以排除壞死細(xì)胞。本結(jié)果顯示,MT處理SW1990細(xì)胞后，細(xì)胞早期凋亡率增加，提示MT抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

腫瘤細(xì)胞凋亡是一個(gè)涉及多基因參與的過程,包括p53 、c-myc 、Fas、bcl-2、bax 等基因[5]，其中，bcl-2是最主要的細(xì)胞凋亡抑制基因[6]，bax是最主要的細(xì)胞凋亡促進(jìn)基因[7]，bcl-2/bax的比率影響細(xì)胞凋亡的發(fā)生，是腫瘤發(fā)生的決定因素[8-9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MT處理SW1990細(xì)胞后其Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl-2/Bax的比值降低，進(jìn)一步證實(shí)MT促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，為MT治療胰腺癌的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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2008-12-10)

(本文編輯：呂芳萍)

EffectsofmelatoninonproliferationandapoptosisinhumanpancreaticcancercelllineSW1990

ZHUHua,XUChun-fang,YEJiang-xin.

DepartmentOfGastroenterology,FirstPeople′sHospitalofSuzhou,SuzhouUniversity,Suzhou215006,China

XUChun-fang，Email:xcf601@163.com

ObjectiveTo investigate the effect of melatonin (MT) on the proliferation and apoptosis in human pancreatic cancer cell SW1990 in vitro.MethodsSW1990 cell line were treated with MT at different concentrations (0.1, 0.5, 1.0, 2.5 and 5.0 mmol/L) and at different time points (24 h, 48 h and 72 h). Cell proliferation was evaluated by MTT and apoptosis was determined by AnnexinV/PI, cell cycle was determined by flow cytometry, and Western Blot was used to detect the expression of Bcl-2 and Bax.ResultsMT could inhibit the proliferation of SW1990 cell in a time and dose dependent manner. 48 h after 0.1～5.0 mmol/L MT treatment, the proliferation inhibitory rate was 7.4%～85.8%, the proportion of SW1990 cell in phase G0/G1was 72.6%～85.33%. 48 h after 1～5.0 mmol/L MT treatment, the apoptosis rate was 21.5%～41.7%, and the expression of Bcl-2 was down-regulated and the ratio of Bcl-2/Bax decreased.ConclusionsMT could inhibit the proliferation of SW1990 pancreatic cancer cells by up-regulating the expression of Bax and down-regulating the expression of Bcl-2, as well as enhancing apoptosis and blocking SW1990 cell in phase G0/G1.

Pancreatic neoplasms; Cell proliferation; Apoptosis; Melatonin

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.02.013

215006 蘇州，蘇州大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院消化科

許春芳，Email:xcf601@163.com