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(1.桂林旅游學(xué)院,酒店管理學(xué)院,廣西桂林 541006;2.合肥工業(yè)大學(xué),食品科學(xué)與工程學(xué)院,安徽合肥 230009)

多糖是一類在動植物和微生物體內(nèi)廣泛存在且種類繁多的生物大分子,具有抗氧化、抗腫瘤、抗凝血、抗病毒等生物活性[1-2]。由于其具有獨特的藥理活性且毒性低,引起了食品和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究人員的極大關(guān)注[3]?？v觀近幾十年的研究發(fā)現(xiàn),多糖在生命體的生長和發(fā)育過程中起著重要作用[4]。但通常情況下,天然多糖的生物活性較弱,因此常采用一些方法改善其生物活性,而硫酸化修飾是天然多糖結(jié)構(gòu)修飾的常用方法之一。迄今為止,天然多糖常用的硫酸化修飾方法主要包括濃硫酸法、氯磺酸-吡啶法、三氧化硫-吡啶法等。應(yīng)用硫酸化修飾方法,對天然多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)進行改造,可改善多糖的生物活性,如抗病毒類硫酸化多糖,增強了其抗病毒活性,該硫酸化多糖衍生物己進入臨床研究階段。

多糖硫酸化修飾,是指利用硫酸化修飾方法,使得多糖分子中的羥基被硫酸基取代形成多糖硫酸化衍生物的過程。很多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),多糖的生物活性與其結(jié)構(gòu)有關(guān),通過硫酸化修飾,可以改善多糖原有的生物活性或產(chǎn)生新的功能活性[5-6]。本文闡述了天然多糖的硫酸化修飾方法及其對生物活性的影響研究,以期為今后開展硫酸化多糖的深入研究及開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 天然多糖主要的硫酸化修飾方法

1.1 濃硫酸法

濃硫酸法,是用濃硫酸作為多糖硫酸化基團的來源,其反應(yīng)原理是在酯化反應(yīng)過程中,硫酸作為一種酯化試劑,在吡啶的催化下,實現(xiàn)對天然多糖的結(jié)構(gòu)修飾。反應(yīng)結(jié)束后,調(diào)節(jié)混合溶液的pH至中性,然后進一步濃縮和冷凍干燥,得到硫酸化多糖[7]。濃硫酸法的優(yōu)點是反應(yīng)條件穩(wěn)定、試劑毒性相對較低。然而,缺點是反應(yīng)過程中伴隨有硫酸多糖的碳化和降解。Jiang等[8]采用濃硫酸法制備了硫酸化龍眼多糖,傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果表明,其結(jié)構(gòu)中存在S=O和C-O-S鍵,顯示其發(fā)生了硫化反應(yīng)。Sun等[9]利用濃硫酸法制備了一系列具有不同硫酸根取代度和分子量的多糖硫酸衍生物,并以三氧嘧啶-吡啶絡(luò)合物為試劑進一步合成出了硫酸化的(1-3)-β-D-葡聚糖。Zhu等[10]采用濃硫酸法制備了硫酸化蟲草多糖,并通過對硫酸化多糖進一步磺化處理,提高了天然多糖的抗腫瘤活性。

1.2 氯磺酸-吡啶法

采用氯磺酸-吡啶法對天然多糖進行硫酸化修飾,其原理是多糖溶解于溶劑中與酯化試劑進行反應(yīng),致使多糖殘基上的某些羥基被酯化試劑提供的硫酸基團取代,經(jīng)透析和凍干后獲得硫酸化多糖[11-12]。反應(yīng)過程中所用的試劑比例、反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度是影響多糖硫酸取代度的三個主要因素。通常采用正交試驗和響應(yīng)面試驗優(yōu)化天然多糖硫酸化修飾的最佳反應(yīng)條件[13-14]。氯磺酸吡啶法中所用的氯磺酸是一種強酸,在酸性條件下可促進多糖的降解,在硫酸化修飾過程中提供硫酸基團,進而改變多糖原有的分子結(jié)構(gòu)。Wei等[15]將實驗過程中的吡啶替換成4-二甲氨基吡啶(DMAP),可進一步優(yōu)化硫酸化修飾效果。這種方法的優(yōu)點是產(chǎn)率高、原料廉價易得、可以得到高取代度的產(chǎn)物,回收方便,而缺點是氯磺酸有劇毒,需要提前準(zhǔn)備試劑,反應(yīng)過程劇烈。

1.3 三氧化硫-吡啶法

三氧化硫吡啶法,也是天然多糖硫酸化修飾的常用方法。首先,將三氧化硫放入三頸燒瓶中,加入吡啶后連續(xù)攪拌。然后在適當(dāng)溫度下加入多糖粉末,反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫,氫氧化鈉調(diào)節(jié)混合液的pH至中性。最后,經(jīng)過乙醇沉淀、流水透析和冷凍干燥后,獲得硫酸化多糖[16-17]。三氧化硫法的優(yōu)點是操作簡單方便,可以得到較高硫酸化基團取代度的多糖衍生物。其缺點是所用試劑昂貴,不適用于大批量制備硫酸化多糖。

2 硫酸化多糖的生物活性

2.1 抗氧化活性

天然多糖因其本身大量存在的羥基及其糖蛋白復(fù)合物而具有抗氧化活性[18]。通過使用多種化學(xué)修飾和結(jié)構(gòu)改造方法,對多糖的分子結(jié)構(gòu)進行衍生修飾,其生物活性也會發(fā)生一定程度的改善,而硫酸化修飾已被廣泛應(yīng)用于增強多糖的抗氧化活性。

申進文等[19]比較了硫酸化香菇多糖6種不同組份的抗氧化活性,結(jié)果顯示,硫酸化香菇多糖具有抗氧化活性,并且存在不同程度的量效關(guān)系。多糖的分子量不同,硫酸化香菇多糖的抗氧化活性存在差異,烤煙多糖的硫酸化修飾和抗氧化活性的研究中也得到類似的結(jié)論[20]。劉玉鳳等[21]研究了腸滸苔多糖硫酸化取代度與抗氧化活性的關(guān)系,結(jié)果表明,隨著硫酸化多糖的硫酸根取代度的上升,其抗氧化性呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。

多糖的硫酸根取代度差異對其生物活性也產(chǎn)生一定的影響。Wang等[22]通過對白沙蒿多糖(Artemisiasphaerocephalapolysaccharide,ASP)進行硫酸化修飾,制備了具有5種不同硫酸根取代度的硫酸化衍生物,通過體外評價硫酸化衍生物結(jié)構(gòu)和抗氧化活性關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn),硫酸化白沙蒿多糖(SASP)顯示出比天然的白沙蒿多糖更好的抗氧化活性,硫酸根基團取代度對抗氧化活性具有顯著的影響。Xie等[23]利用吡啶-三氧化硫作為硫酸化修飾試劑,對青錢柳多糖(Cyclocaryapaliuruspolysaccharide)進行硫酸化衍生,制備了4種具有不同取代度(0.12～0.92)的硫酸化衍生物,結(jié)果證實青錢柳多糖經(jīng)過硫酸化修飾后,其多糖分子中的糖醛酸含量、多糖分子量、單糖組成和多糖分子構(gòu)象均發(fā)生了明顯的變化。通過進一步的理化性質(zhì)及生物活性分析實驗,揭示了硫酸化衍生物的化學(xué)組成、分子量和一些必要的結(jié)構(gòu)單元是決定其抗氧化活性的主要因素。Xu等[24]使用氯磺酸/吡啶(CSA/Pyr)的方法對迷果芹多糖(SGP)進行化學(xué)修飾,以獲得其硫酸化衍生物(S-SGP),與SGP相比,S-SGP具有相對較低的分子量,單糖組成未發(fā)生變化,抗氧化活性測定實驗結(jié)果顯示,S-SGP擁有比SGP更好的抗氧化活性,表明S-SGP的抗氧化性可能與多糖分子量及硫酸基團取代度有關(guān)。

2.2 抗凝血活性

采用不同的硫酸化條件,以獲得不同硫酸根取代度和分子量的多糖衍生物,和天然多糖相比,其抗凝血活性會得到進一步增強。Du等[25]從粒毛盤菌中分離得到胞外多糖(LEP-1),并對其進行硫酸化修飾得到硫酸多糖SLEP-1,取代度為1.97。體外抗凝血活性實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)SLEP-1與LEP-1均可以有效延長正常小鼠血漿的凝血活酶時間(APTT)和凝血酶時間(TT),并呈劑量效應(yīng)關(guān)系,SLEP-1比LEP擁有更好的抗凝血活性。Lu等[12]利用CSA-Pyr方法對柿子多糖進行硫酸化修飾制備硫酸化柿子多糖,通過凝血實驗測定APTT研究其硫酸化多糖的抗凝血活性,結(jié)果表明,硫酸化柿多糖的抗凝活性不僅強烈依賴于硫酸根取代度和多糖分子量,而且還依賴于硫酸化條件。肝素是由兩種以上多糖相互交織鏈接的硫酸化多糖聚合物,體內(nèi)外實驗及臨床顯示,其具有抗凝血活性。

少量研究表明,目前包括肝素在內(nèi)的治療凝血的藥物往往會引起不正常的流血現(xiàn)象、血小板減少現(xiàn)象等副作用[26-27]。源自我國的傳統(tǒng)中藥紅芪的紅芪多糖硫酸酯,是一種天然的硫酸化多糖,特點是硫酸根取代度較低,而且本身沒有抗凝血活性。郭龍等[28]制備出不同硫代度的硫酸化紅芪多糖(SHG),體外實驗結(jié)果表明,高硫酸根取代度的紅芪多糖具有較好的抗凝血活性,并且隨硫酸根取代度的不斷增大,其抗凝血活性呈現(xiàn)出不同程度的改善。另外的一些研究表明,白樹花多糖硫酸酯、玉米芯硫酸化多糖、黑靈芝葡聚糖高活性硫酸化多糖等都是一類高抗凝血活性的硫酸化多糖[29-31]。

2.3 抗腫瘤活性

腫瘤,一直是迫害人類健康的可怕疾病之一。許多研究證實,硫酸化多糖通過抑制腫瘤細(xì)胞的生長繁殖、致使腫瘤細(xì)胞死亡、使腫瘤細(xì)胞停滯在特定的細(xì)胞周期、干擾腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移等多種形式可以發(fā)揮抗腫瘤作用[32]。

王君敏等[33]利用氯磺酸-吡啶法對枸杞多糖進行硫酸化修飾,得到3種硫酸化枸杞多糖sLBPS30、sLB-PS70和sLBPS,檢測了這三種多糖對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖和食管癌EC109細(xì)胞的影響,結(jié)果表明,經(jīng)硫酸化修飾后的多糖能顯著增強體外脾淋巴細(xì)胞增殖,同時促進淋巴細(xì)胞的四種細(xì)胞因子的分泌,并能抑制EC109細(xì)胞生長,降低EC109細(xì)胞遷移速率,且與硫酸基含量有一定的關(guān)系。從藥用真菌茶藨子木層孔菌中分離得到葡聚糖茶藨子木層孔菌多糖(PRP),研究結(jié)果顯示,PRP不能使得腫瘤細(xì)胞生長受到抑制。然而,通過進一步的硫酸化后,PRP對腫瘤細(xì)胞的生長表現(xiàn)出顯著的抑制作用[34]。

目前的研究表明,巖藻多糖硫酸酯可以通過誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生凋亡以及自噬性程序性細(xì)胞死亡,從而抑制癌細(xì)胞的生長[35]。Wei等[15]從紅芪根莖中分離純化獲得紅芪多糖(Radix hedysari polysaccharide,RHP),并利用氯磺酸法,用DMAP作為催化劑制備了紅芪多糖的四種硫酸化衍生物RHPS。與RHP相比,所有RHPS對A549細(xì)胞和BGC-823細(xì)胞均表現(xiàn)出顯著的抑制作用。流式細(xì)胞實驗結(jié)果表明,RHPS可以使A549細(xì)胞和BGC-823細(xì)胞的生長阻滯在細(xì)胞周期的G1期,經(jīng)硫酸化修飾后,其抗腫瘤活性得到了顯著增強。Zhu等[10]通過對古尼蟲草多糖(Cordyceps_gunnii mycelia polysaccharide)進行硫酸化修飾獲得硫酸化多糖SPS50,細(xì)胞實驗結(jié)果顯示,SPS50對K562細(xì)胞的生長表現(xiàn)出明顯的抑制作用,抑瘤率為69.92%,其抗腫瘤活性明顯優(yōu)于PS50。Jiang等[8]采用硫酸法對龍眼多糖(longan polysaccharide,LP)進行硫酸化修飾,得到一種硫酸化衍生物L(fēng)P1-S。細(xì)胞實驗結(jié)果表明,LP1和LP1-S可以刺激淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的增殖,呈劑量依賴關(guān)系。LP1和LP1-S對HONE1腫瘤細(xì)胞的生長均表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤活性,且LP1-S的抗腫瘤活性比LP1更強。

通過特定的硫酸化修飾方法,改變其天然多糖原有的硫酸根取代度,可增強其抗腫瘤活性。Li等[36]從脫脂米糠中分離純化獲得米糠多糖(Rice bran polysaccharide,RBP),并采用氯磺酸-吡啶法(CSA-Pyr)制備了9種具有不同硫酸根取代度的硫酸脫脂米糠多糖(sRBPS),MTT法測定其抗腫瘤活性實驗結(jié)果表明,當(dāng)硫酸根取代度在0.81～1.29范圍內(nèi)時,碳水化合物含量在41.41%～78.56%范圍內(nèi),硫酸化衍生物在體外表現(xiàn)出相對強的抗腫瘤活性,其中具有最高硫酸根取代度(1.29)和碳水化合物含量(78.56%)的sRBPS2對B16和HePG2細(xì)胞表現(xiàn)出更加明顯的生長抑制。

2.4 抗病毒活性

研究表明,經(jīng)過硫酸酯化后硫酸酯化多糖具有更加顯著的抑制HIV活性[37-38]。王歡等[39]用氨基磺酸法對黨參多糖(Codonopsispilosulapolysaccharides-1,CPPS-1)進行硫酸化修飾,檢測修飾前后CPPS-1對體外抗Ⅰ型單純皰疹病毒(Herpessimplexvirus type I,HSV-I)的作用,發(fā)現(xiàn)CPPS-1對HSV-I有一定的預(yù)防效果,但無治療效果,而經(jīng)過硫酸化修飾后的CPPS-1對HSV-I具有較好的預(yù)防及治療效果。Zhao等[40]對銀耳多糖(Tremellapolysaccharide,TPS)進行硫酸化修飾得到兩種硫酸化衍生物sTPStp和sTPS70c,用未硫酸化的三種多糖TPStp,TPStc和TPS70c作為對照,進行新城新城疫病毒(NDV)感染細(xì)胞實驗,結(jié)果表明,5種多糖均可以顯著抑制NDV對雞胚成纖維細(xì)胞的感染能力,且硫酸化衍生物sTPStp對NDV病毒的抑制率最高。Lu等[13]通過氯磺酸-吡啶法對淫羊藿多糖(Epimediumpolysaccharide,EPS)進行硫酸化修飾,獲得9種硫酸化多糖EPS(sEPS),包括sEPS1,sEPS2,sEPS3,sEPS4,sEPS5,sEPS6,sEPS7,sEPS8和sEPS9,利用MTT實驗分析它們對IBDV感染CEF細(xì)胞的影響,結(jié)果表明,修飾的sEPS具有比原糖EPS有更加顯著增強的CEF抵抗IBDV感染,特別是sEPS2和sEPS5，具有更好的抵抗IBDV感染CEF細(xì)胞的能力?？偟膩碚f,硫酸化修飾改變了天然多糖原有的化學(xué)結(jié)構(gòu),使其特定的生物活性得到進一步活化。

3 展望

硫酸化多糖作為經(jīng)硫酸化修飾而生的產(chǎn)物,具有廣泛的抗氧化、抗凝血、抗腫瘤、抗病毒等多種生物活性和藥理作用?？v觀現(xiàn)有資料,很多學(xué)者在活性成分提取、分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定、功能活性及作用機理等方面做了大量的研究工作,但硫酸化多糖作為一種衍生物,其特定結(jié)構(gòu)與活性的內(nèi)在聯(lián)系尚不清楚,仍需要進一步研究其結(jié)構(gòu)與生物活性的作用機制,揭示出生物活性多糖的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。隨著人們對硫酸化多糖研究的逐步深入,必將使得硫酸化多糖的應(yīng)用領(lǐng)域得到進一步拓寬。