韓靜芳　陳瑞愛(ài)　邵定勇　唐滿華　梁桂益

摘要以偽狂犬病毒為載體表達(dá)其他病原體抗原蛋白是偽狂犬病疫苗研究的一個(gè)重要方向。根據(jù)已發(fā)表的偽狂犬病毒(PRV)Ra株TK基因序列設(shè)計(jì)2對(duì)引物,用PCR方法得到同源左右臂,克隆入PUC19載體中。利用平末端連接的方法將綠色熒光蛋白(EGFP)的基因表達(dá)盒插入到缺失位點(diǎn),并在下游引入1個(gè)多克隆位點(diǎn),構(gòu)建缺失通用轉(zhuǎn)移載體PUC19TK-EGFP。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒將PUC19TK-EGFP和PRV-Ra株的基因組共轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞,以EGFP為標(biāo)記基因,用噬斑法得到純化的重組病毒,命名為TK/EGFP,為研制以偽狂犬病毒為載體的二價(jià)或多價(jià)基因工程疫苗奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞偽狂犬病毒; TK基因;通用轉(zhuǎn)移載體

中圖分類號(hào) S858.292 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào) 1007-5739(2009)15-0308-03

ConstructionandPrimaryApplicationofUniversalTransferVectorDeletingTK ofPseudorabiesVirus

HAN Jing-fangCHEN Rui-ai*SHAO Ding-yongTANG Man-huaLIANG Gui-yi

(Guangdong Dahuanong Animal Health Products Co., Ltd., XinxingGuangdong 527400)

AbstractUse of PRV as a system for expression of foreign antigens has been increasingly evaluated as an alternative to conventional vaccine production system. In this study,according to the Genbank open sequence,two pairs of primer were designed in order to obtain homology recombination arms of TK gene of PRV-Ra strain. Then both of them were inserted into PUC19 vector. A report gene expression cassette,EGFP containing a multicloning sites,was inserted into PUC19HEK/TK to construct a universal transfer vector PUC19TK-EGFP. It was used to co-transfect BHK cell together with the genome of PRV Ra strain,a recombinat virus was selected and purified 3 times in BHK cell through EGFP gene and named TK/EGFP. The above results demonstrated that the universal transfer vector might be contributive to developed bivalence or multivalence genetically engineering vaccine in the future.

Key wordsPseudorabies virus ;TK gene;universal transfer vector

偽狂犬病(Pesudorabies, PR)是由偽狂犬病病毒(Pesudo-rabies virus,PRV)引起的多種家畜和野生動(dòng)物的一種急性傳染病,是嚴(yán)重危害全球養(yǎng)豬業(yè)的傳染病之一[1]。 PRV屬于皰疹病毒科(Herpesviridac)、α-皰疹病毒亞科(Alphaher-pesririnae)水痘病毒屬(Varicello virus)的皰疹病毒Ⅰ型(Porcine herpesvirus TypeⅠ),其基因組為雙鏈DNA,全長(zhǎng)約150kb,編碼72～100種蛋白質(zhì),存在許多與病毒復(fù)制無(wú)關(guān)的非必需基因,在這些非必需基因中能夠插入其他病原的免疫原性基因或報(bào)告基因而不影響病毒的增殖。PRV的這種特性為其作為病毒活載體用于構(gòu)建二價(jià)或多價(jià)基因工程疫苗提供了分子操作基礎(chǔ)[2]。病毒的胸苷激酶基因是PRV的主要毒力基因,也是病毒的非必需基因,將該基因缺失不影響病毒在細(xì)胞中的增殖,但其毒力大大降低[3]。本研究用PCR方法擴(kuò)增了TK基因的左右臂TKL和TKR,并克隆到PCU19載體中,這樣在TKL和TKR基因之間缺失了203bp,用平末端連接法在此位點(diǎn)插入帶CMV啟動(dòng)子和多克隆位點(diǎn)的EGFP報(bào)告基因,構(gòu)建通用轉(zhuǎn)移載體,并用蝕斑法得到純化的缺失重組病毒TK-/EGFP。由于在EGFP的下游引入1個(gè)多克隆位點(diǎn),這為將來(lái)構(gòu)建以偽狂犬病毒為載體基因工程苗奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病毒與細(xì)胞系。偽狂犬病毒(PRV)Ra株購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所,BHK-15細(xì)胞由廣東大華農(nóng)生藥研發(fā)中心保存。

1.1.2質(zhì)粒與菌株。載體pcDNA 3.0(含EGFP基因)、載體PUC19以及大腸桿菌DH5α均由廣東大華農(nóng)生藥研發(fā)中心保存。

1.1.3工具酶與試劑。LA Taq DNA聚合酶、XbaⅠ、KpnⅠ等多種限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、Klenow末端補(bǔ)平酶以及DNA Marker DL 2000等均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司;質(zhì)?；厥赵噭┖小NA膠回收試劑盒購(gòu)自上海生物工程公司;脂質(zhì)體Lipofectamine 2000為Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.1.4培養(yǎng)基與血清。細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM和小牛血清為GIBCO公司產(chǎn)品;細(xì)菌培養(yǎng)用LB培養(yǎng)基和瓊脂粉均購(gòu)自廣州美津生物技術(shù)有限公司。

1.1.5PCR引物設(shè)計(jì)。參照Genbank上發(fā)表的PRV-Ra株的TK基因序列合成2對(duì)引物用以擴(kuò)增左右重組臂(TKL 、TKR分別為959bp和977bp),由上海生物工程公司合成。

P-TKLs:5′-ATTGGTACCGCTGCTCGTCCACCTC GG-3′(KpnⅠ)

P-TKLa:5′-GTCTCTAGAAGTACGCCATCGGCTC GG-3′(XbaⅠ)

P-TKRs:5′-GTCTCTAGAGTCTTTGACCGCCACC CG-3′(XbaⅠ)

P-TKRa:5′-ATTGCATGCCCGACCAGGACGAACA GG-3′(SphⅠ)

合成引物Ps、Pa,用以檢測(cè)重組病毒中TK缺失基因,大小約為600bp,由上海生物工程公司合成。

Ps:5′-GCGTTCGTAGAAGCGGTTGTG-3′

Pa:5′-GTGTTGACCAGCATGGCGTAGA-3′

合成引物Ps-EGFP、Pa-EGFP,用以檢測(cè)重組病毒中EGFP基因,大小為206bp,由上海生物工程公司合成。

Ps-EGFP:5′-GGGAGGATTGGGAAGACA-3′

Pa-EGFP:5′-AAGGGAAGAAAGCGAAAG-3′

1.2方法

1.2.1病毒的增殖與基因組的提取。病毒的增殖和基因組的提取,按參考文獻(xiàn)[4]略作修改進(jìn)行。

1.2.2TKL、TKR臂的PCR擴(kuò)增。在50μL的PCR體系中含有如下成分:2×GC BufferⅡ(5mM Mg2+Puls)25μL、dNTP Mixture(2.5mM)2μL、Ps(5μM/L)3μL、Pa(5μM/L)3μL、模板2μL、LA Taq(5U/μL)1μL、ddH2O 13μL。均勻混合后迅速放入PCR儀進(jìn)行以下程序:先94℃預(yù)變性3min,再94℃變性30s,55℃復(fù)性30s,72℃延伸1min進(jìn)行30個(gè)循環(huán),然后72℃延伸10min,PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3含EGFP基因表達(dá)盒的重組轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建。用KpnⅠ/XbaⅠ同時(shí)酶切TKL和PUC19,回收相應(yīng)片段,連接、轉(zhuǎn)化、克隆、鑒定,得到PUC19-TKL;再用SphⅠ/XbaⅠ雙酶切TKR和PUC19-TKL,回收相應(yīng)片段,連接、轉(zhuǎn)化、克隆、鑒定,得到PUC19-TK。依次消除PUC19-TK中的HindⅢ、EcoRⅠ和KpnⅠ等3個(gè)酶切位點(diǎn),得到的質(zhì)粒稱為PUC19/HEK-TK。

用XbaⅠ酶切質(zhì)粒PUC19/HEK-TK,回收片段用Klenow補(bǔ)平并去磷酸化;同時(shí)用SspⅠ/StuⅠ酶切質(zhì)粒pcDNA3.0-EGFP,回收大小為2.9kb含CMV啟動(dòng)子的EGFP片段,用Klenow補(bǔ)平,將兩片段連接、轉(zhuǎn)化、克隆、鑒定,得到重組轉(zhuǎn)移載體PUC19TK-EGFP。

1.2.4重組病毒的構(gòu)建、篩選、純化及鑒定。

(1)共轉(zhuǎn)染。將重組轉(zhuǎn)移載體PUC19TK-EGFP和PRV Ra的基因組用脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染法按Lipofectamine 2000 說(shuō)明書方法轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞,待細(xì)胞出現(xiàn)80%病變時(shí)收獲病毒。

(2)重組病毒的篩選及純化。將收獲的病毒反復(fù)凍融3次后10倍系列稀釋,接種于BHK細(xì)胞已長(zhǎng)成單層的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,37℃吸附1h,用PBS洗滌3次,每孔加入2mL含2%瓊脂糖、3%小牛血清的無(wú)酚紅DMEM覆蓋,置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中,24h后,再覆蓋1.5mL含1/15 000中性紅和2%瓊脂糖的無(wú)酚紅DMEM,于37℃ 5%CO2培養(yǎng)至噬斑出現(xiàn),刮下發(fā)熒光的單個(gè)分散的噬斑,與BHK細(xì)胞同步接種于24孔板中進(jìn)行增殖,待細(xì)胞出現(xiàn)80%以上病變時(shí)收獲病毒。如此反復(fù)純化3次。

(3)重組病毒的PCR鑒定。①重組病毒TK缺失基因的鑒定。將篩選到的病毒擴(kuò)大培養(yǎng)后提取基因組,用Ps、Pa引物擴(kuò)增TK缺失基因,同時(shí)用原始毒株基因組作對(duì)照。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。②重組病毒EGFP基因的鑒定。將篩選到的病毒擴(kuò)大培養(yǎng)后提取基因組,用Ps-EGFP、Pa-EGFP引物擴(kuò)增EGFP缺失基因片段。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2結(jié)果與分析

2.1TK基因重組左右臂的PCR擴(kuò)增

以PRV Ra株基因組為模板,用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,在1%的瓊脂糖凝膠中電泳,左臂可見(jiàn)擴(kuò)增出大小約1 000bp的片段,與預(yù)期結(jié)果相符(見(jiàn)圖1),測(cè)序結(jié)果略。

2.2重組轉(zhuǎn)移載體的鑒定

利用設(shè)計(jì)在TKL和TKR基因片段上的酶切位點(diǎn)對(duì)載體PUC19-TK分別進(jìn)行雙酶切,均得到約1 000bp的片段,與預(yù)期相符(見(jiàn)圖2)。位于通用轉(zhuǎn)移載體PUC19-EGFP多克隆位點(diǎn)中的EcoRⅠ為單一酶切位點(diǎn),酶切后成1條帶,大小約為7 600bp,與預(yù)期相符(見(jiàn)圖3)。

2.3重組病毒的純化及PCR鑒定

轉(zhuǎn)染產(chǎn)物接種6孔板后,約培養(yǎng)36h后出現(xiàn)空斑,在倒置熒光顯微鏡下可以觀察到部分病毒噬斑發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光,說(shuō)明EGFP基因在重組的PRV中獲得表達(dá),從而證實(shí)所構(gòu)建的轉(zhuǎn)移載體是可行的。用原始毒株和經(jīng)過(guò)3次純化的重組病毒的基因組DNA為模板,用Ps、Pa檢測(cè)引物擴(kuò)增TK缺失片段,原始毒株得到627bp的片段,而重組病毒株為陰性,證實(shí)已得到均一的重組病毒(見(jiàn)圖4)。

用重組病毒的基因組DNA為模板,Ps-EGFP、Pa-EGFP為引物PCR擴(kuò)增EGFP基因中2 047～2 253之間長(zhǎng)206bp的片段,結(jié)果與預(yù)期一致,表明EGFP基因確實(shí)已經(jīng)插入到PRV-Ra株的基因組中(見(jiàn)圖5)。

3討論

TK基因是偽狂犬病病毒的主要毒力基因,它與病毒在細(xì)胞中的增殖無(wú)關(guān),TK基因缺失后的病毒同野毒株一樣在細(xì)胞培養(yǎng)上增殖良好,但毒力和潛伏感染的能力大大降低[5]。本研究以PRV TK基因?yàn)榛A(chǔ),通過(guò)擴(kuò)增其同源重組左右臂,缺失203bp的基因片段,這一缺失涉及到PRV中較為保守的序列,因此將影響到TK的功能,從而降低病毒毒力。

通過(guò)同源重組來(lái)產(chǎn)生重組病毒是一種廣泛使用的構(gòu)建重組病毒的方法,但如果沒(méi)有有效的篩選標(biāo)記,工作量將非常大,要獲得重組病毒將是非常困難的。為了克服這一問(wèn)題,本研究將一種全新的報(bào)告基因——增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP基因插入載體PUC19/HEK-TK中用以篩選重組病毒。EGFP基因可實(shí)時(shí)表達(dá),無(wú)需另外增加底物或輔助因子協(xié)作指示,如果病毒發(fā)生重組,在倒置熒光顯微鏡下就可以觀察到明亮的綠色熒光,大大簡(jiǎn)化了篩選過(guò)程。

本試驗(yàn)用酶切的方法將帶有pcDNA 3.0整套真核表達(dá)元件(CMV啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)區(qū)、BGH的Poly A信號(hào)序列)的基因的片段切下來(lái),用平末端連接的方法插入到PUC19/HEK-TK載體中,得到轉(zhuǎn)移載體PUC19TK-EGFP。這樣控制外源基因表達(dá)的啟動(dòng)子是CMV,CMV是一個(gè)適于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的高效啟動(dòng)子。試驗(yàn)也表明,將轉(zhuǎn)移載體與病毒基因組共轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞后,綠色熒光蛋白EGFP基因在CMV啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下獲得了穩(wěn)定表達(dá),同時(shí)也證實(shí)該通用轉(zhuǎn)移載體的有效性,這為下一步構(gòu)建表達(dá)其他病毒的重組疫苗提供了理論基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)通過(guò)酶切、補(bǔ)平的方法消除了pUC19中的Hind Ⅲ/EcoRⅠ/KpnⅠ等3個(gè)酶切位點(diǎn),使EGFP表達(dá)盒中引入了1個(gè)常用的限制性內(nèi)切酶的多克隆位點(diǎn),構(gòu)成通用轉(zhuǎn)移載體PUC19-TK/EGFP,將來(lái)可以用1個(gè)或多個(gè)外源基因置換EGFP基因,進(jìn)行多基因重組,從而產(chǎn)生“一針?lè)乐螏撞　钡亩鄡r(jià)基因工程苗。

4參考文獻(xiàn)

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