張東旭　張　潔　張學(xué)兵　董國興

摘要通過不同培養(yǎng)基、不同激素及添加物對蝴蝶蘭各培養(yǎng)再生途徑的影響進行了概述,為蝴蝶蘭的組培技術(shù)研究提供參考。

關(guān)鍵詞蝴蝶蘭;組織培養(yǎng);研究進展

中圖分類號 Q943.1;S682.31 文獻標(biāo)識碼A文章編號 1007-5739(2009)15-0191-03

蝴蝶蘭(Phalaenopsis)屬熱帶或亞熱帶的蘭科植物,深受人們的喜愛,研究和開發(fā)蝴蝶蘭的組織培養(yǎng)具有重要的意義[1]。組織培養(yǎng)是蝴蝶蘭快速繁殖的有效方式,目前主要有3條途徑:一是利用蝴蝶蘭雜交種子在無菌條件下誘導(dǎo)發(fā)芽,獲得再生植株[2];二是從離體器官誘導(dǎo)產(chǎn)生原球莖(Protocorm like-body,以下簡稱PLB),通過原球莖的增殖、分化獲得再生植株,即原球莖再生途徑[3,4];三是通過離體器官誘導(dǎo)產(chǎn)生叢生芽,通過培養(yǎng)叢生芽獲得再生植株,即器官再生途徑[4-7]。

1無菌播種再生途徑

蝴蝶蘭經(jīng)人工授粉可獲得種子,但種子個體極其微小,結(jié)構(gòu)簡單,沒有胚乳,只有1層極薄的種皮,通常在自然狀態(tài)下很難萌發(fā),需經(jīng)組織培養(yǎng)無菌播種才能獲得植株。在蝴蝶蘭開花時選擇優(yōu)良植株進行自交或雜交授粉,生長4～6個月后尚未開裂的蒴果可用于試管無菌播種。由于蒴果內(nèi)種子數(shù)量達幾千萬之多,1個蒴果便可繁殖出成千上萬的植株[8]。通過無菌播種人工培養(yǎng),能夠在短期內(nèi)獲得大量幼小植株,是現(xiàn)階段經(jīng)濟有效的快速繁殖方法,也是工廠化育苗的重要途徑。種子無菌播種10d后胚明顯膨大,呈鵝黃色,陸續(xù)變成綠色,約1個月的時間形成原球莖)。隨后,原球體拉長,同時原球體上伴隨著長出白色根毛狀物,接著在頂端生長點處長出芽鞘,芽鞘不斷長大,形成第1片鞘葉。至2個月時,于第1片鞘葉對面長出第2片鞘葉,隨著鞘葉的生長,2～3個月的時間在2片鞘葉之間長出真葉。最后,轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上形成再生植株[8-10]。

魏翠華等[9]研究發(fā)現(xiàn),添加香蕉汁對蝴蝶蘭種子發(fā)芽、原球體形成以及葉片的生長具有促進作用,水解乳蛋白對種子萌發(fā)有抑制作用,比較光照和黑暗2種培養(yǎng)條件,種子萌發(fā)無明顯差異。章玉平等[10]研究表明,外源植物生長調(diào)節(jié)劑對種子萌發(fā)有抑制作用,天然物質(zhì)如蘋果汁、香蕉汁、胰蛋白胨和活性炭對種子萌發(fā)具有促進作用。不同雜交組合的親本基因型親和力不同,對種子播種的發(fā)芽率和生長發(fā)育狀況有很大影響[9]。魏翠華等[9]認(rèn)為在培養(yǎng)過程中種子發(fā)芽的速度與接種到培養(yǎng)瓶中的微滴濃度有關(guān),濃度高的,所含種子量多,水量少,發(fā)芽就快些,顯示出發(fā)芽的“群體效應(yīng)”。

在種子培養(yǎng)過程中用的培養(yǎng)基主要有KC[10]、1/2MS[10]、MS[11]、Kyoto[11]和VW[12]培養(yǎng)基等。張曉申等[13]研究表明,改良的KC培養(yǎng)基中種子發(fā)芽率高達91.2%,周俊輝等[14]認(rèn)為改良KC培養(yǎng)基處理蝴蝶蘭種子后生長出原球莖的增殖速度最快、長勢最強。通過雜交種子無菌培養(yǎng)能在短時間內(nèi)獲得大量的再生植株,但由于蝴蝶蘭種子苗是一種雜交品系,因此后代變異率高,除了少數(shù)自花系列較穩(wěn)定以外,難以形成品質(zhì)均一的大規(guī)模栽培品種。

2原球莖(PLB)再生途徑

1974年,Intuwong等利用蝴蝶蘭莖尖誘導(dǎo)出原球莖(PLB),再由原球莖(PLB)分化成幼苗,最后形成完整的再生植株,從而成為蝴蝶蘭種苗生產(chǎn)最有效的方式之一[15]。

大量的研究結(jié)果表明,誘導(dǎo)蝴蝶蘭原球莖采用的外植體主要有莖尖[3]、根段[16]、花梗苗根尖[17]、花梗腋芽[18]、葉片[19-22]、胚[23]、花葶節(jié)間[24]、花梗節(jié)或花梗節(jié)間切段[25]和種子[26-28]等。大量的研究報道表明,不同外植體的誘導(dǎo)率存在差異,陳勇等[3]、楊美純等[22]認(rèn)為莖尖為外植體誘導(dǎo)原球莖狀體發(fā)生則誘導(dǎo)率較高,而潘學(xué)峰等[29]、黃象男等[30]認(rèn)為蝴蝶蘭作為單莖性氣生蘭,用莖尖作為外植體有可能喪失母株,不適宜用來做誘導(dǎo)PLB,秦凡等[31]以莖尖、葉片為外植體進行了研究,莖尖的誘導(dǎo)率為70%,葉片的誘導(dǎo)率為37.8%。同時還發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)原球莖的葉片與切取的部位以及在培養(yǎng)基上放置的方式有關(guān),其中,葉基部誘導(dǎo)率明顯高于葉片中部和葉尖部位,正放在培養(yǎng)基上的葉片原球莖的誘導(dǎo)率明顯高于反放和斜放在培養(yǎng)基上的葉片,反放和斜放在培養(yǎng)基上的葉片幾乎不能誘導(dǎo)原球莖。張元國等[18]以無菌植株的莖尖、葉片、根為外植體進行研究表明,莖尖誘導(dǎo)率較高,只要選擇好培養(yǎng)基且切割得當(dāng),誘導(dǎo)率可達100%,而葉和根誘導(dǎo)率太低。陳勇等[3]取無菌苗的幼葉、莖尖、根尖和花梗等為外植體,以莖尖誘導(dǎo)效果最佳,根尖的原球莖誘導(dǎo)效果最差。潘學(xué)峰等[29]認(rèn)為以葉片為外植體則誘導(dǎo)率較低,一般不高于20%,這與秦凡等、張元國等、陳勇等報道的結(jié)果是相似的。但彭立新等[19]以花梗腋芽、花梗、幼葉片為外植體進行研究,結(jié)果表明幼葉片原球莖體誘導(dǎo)率最高為23%,其他2種外植體誘導(dǎo)率均為零。因此,培養(yǎng)條件、蝴蝶蘭品種不同,結(jié)果也不盡相同。

蝴蝶蘭PLB誘導(dǎo)所采用的基本培養(yǎng)基一般包括MS、1/2MS、VW、B5、KC、花寶及其改良型等,陳勇等[3]、姚麗娟等[21]、魯雪華等[25]、王靜等[32]研究結(jié)果均認(rèn)為1/2MS適合PLB增殖,即蝴蝶蘭的原球莖增殖培養(yǎng)以較低的無機鹽濃度為好。但胡海英等[33]用MS和KC培養(yǎng)基,曾宋君等用G3培養(yǎng)基,李進進等[16]用B5培養(yǎng)基也有取得較好的誘導(dǎo)效果。因此,最適培養(yǎng)基的選擇也不盡相同。

激素常采用6-BA,或6-BA和NAA配合使用。楊美純等[26]、秦凡等[31]研究均表明,6-BA是決定原球莖狀體發(fā)生的主要因子。秦凡等[31]在以葉片為外植體進行研究時發(fā)現(xiàn),6-BA濃度為3.0mg/L時產(chǎn)生原球莖數(shù)目較少,但是,原球莖顆粒大,呈綠色;6-BA濃度增到15.0mg/L時產(chǎn)生原球莖數(shù)不斷減少,且長勢弱,顏色偏黃,極易玻璃化,最后褐化死亡,而2,4-D對蝴蝶蘭的體細胞胚胎發(fā)生有抑制作用。黃象男等[30]利于正交試驗分析結(jié)果表明,6-BA因素的極差(R)最大,培養(yǎng)基因素次之,NAA和AC因素最小,這和楊美純等[22]、秦凡等[31]研究的結(jié)果是一致的。

周俊輝等[14]、王靜等[32]、葉曉青等[34]、王芳等[35]均認(rèn)為適宜濃度的6-BA配合低濃度的NAA更利于PLB增殖。黃象男等[30]認(rèn)為6-BA濃度對原球莖的增殖速度有顯著地影響,較高的細胞分裂素/生長素比值有利于增殖,而較低的細胞分裂素/生長素比值則有利于生根。但因蝴蝶蘭品種及選用的外植體不同,所以最佳激素濃度也不盡相同。

蝴蝶蘭的組織培養(yǎng)過程中易褐化[36],褐變的主要原因是材料傷口分泌出酚類化合物,在多酚氧化酶的作用下轉(zhuǎn)變成醌類物質(zhì)引起的[37],研究表明活性炭[30,31,35]、椰子汁[31],檸檬酸、VC[29]等物質(zhì)能起到一定的緩解褐化作用。同時,pH值對褐化也有重要影響,王冬云等[38]研究表明,當(dāng)培養(yǎng)基pH值為4.5~5.0時,培養(yǎng)物排出的褐變物質(zhì)較多,pH值為5.4~5.5時排出的褐變物質(zhì)較少。

組織培養(yǎng)中常用的有機添加物如椰子汁、香蕉和馬鈴薯等是一類含有氨基酸、礦物質(zhì)、維生素、激素和酶等有機物且成分較為復(fù)雜的天然復(fù)合物[39]。多數(shù)研究證明,它們對細胞和組織的增殖和分化有明顯的促進作用,許多研究人員在天然有機添加物的選擇與應(yīng)用方面做了大量的工作[40-42]。何松林等[39]研究發(fā)現(xiàn)上述有機添加物對PLB分化、幼苗等有良好的促進作用,在3種添加物中,椰子汁和馬鈴薯優(yōu)于香蕉,而添加椰子汁的培養(yǎng)基對PLB分化幼苗的影響與馬鈴薯的差異較小,馬鈴薯將可能是低成本的有效添加物。研究中發(fā)現(xiàn)添加香蕉的培養(yǎng)基能顯著提高幼苗的干質(zhì)量,但不利試管苗葉的生長和根的分化。秦凡等[31]試驗結(jié)果也表明椰子汁、馬鈴薯對增殖有促進作用。陳勇等[3]用椰子汁、蘋果汁、馬鈴薯汁、香蕉汁及荸薺汁進行研究,得到了與何松林等[39]相似的結(jié)論。

除上述各因素對PLB的誘導(dǎo)和增殖有影響外,張元國等[18]在試驗中還發(fā)現(xiàn),切割或針刺對原球莖狀體誘導(dǎo)和增殖作用效果非常好,外植體切割能明顯地提高原球莖狀體誘導(dǎo)率,增殖時切割或針刺有利于增殖而控制分化,否則原球莖很容易分化和生根。同時還發(fā)現(xiàn)原球莖狀體增殖時有群體優(yōu)勢效應(yīng),剛誘導(dǎo)出的原球莖狀體不能過早切割轉(zhuǎn)移,增殖時切塊應(yīng)大于等于3mm,過小易褐化,導(dǎo)致PLB死亡。

3芽繁再生途徑

無菌播種再生途徑和原球莖途徑具有在較短的時間內(nèi)獲得大量的再生植株的優(yōu)點,在蝴蝶蘭繁殖途徑已取得較快的發(fā)展及較為廣泛的應(yīng)用。但無菌播種再生途徑由于蝴蝶蘭種子苗為雜交品系,后代變異率高,因此除了少數(shù)自花系列較穩(wěn)定以外,難以形成品質(zhì)均一的大規(guī)模栽培品種。PLB途徑經(jīng)過脫分化階段同樣也存在較高的變異率。遺傳的穩(wěn)定性問題一直以來都是直接影響組培苗工廠化生產(chǎn)的原因之一[1]。為了進一步減少變異,研究者們進行了大量的研究,王懷宇等[6]和劉榮維等[7]人提出了利用器官再生途徑來實現(xiàn)蝴蝶蘭的快速繁殖,并取了成功。該途徑的優(yōu)點是它是一個芽到叢芽的增殖過程,整個過程均未通過脫分化過程形成愈傷組織,保持了母株的特性,對減少品種變異是極其有利的。蝴蝶蘭器官再生途徑材料通常是取花梗下端的休眠芽作為外植體,通過激素、培養(yǎng)條件等因素的控制,誘導(dǎo)叢生芽,最終獲得大量的再生植株[29,38,43]。其優(yōu)點是不損傷母株[6,13],切取花梗后,不僅不影響母株的正常生長與花芽分化,而且還能從整體上進一步了解新品種的特征特性,特別是對新引進的新品種,可以待其開花和確定其觀賞價值后再進行大量繁殖,以避免不必要的浪費。

花梗基部的休眠芽為花芽,在培養(yǎng)過程中可能有2種發(fā)育方向:一是形成花芽;二是形成營養(yǎng)芽。其不同的發(fā)育方向主要受溫度和不同激素等因素的影響,如果培養(yǎng)的溫度低(低于20℃),則容易向花芽方向分化,發(fā)育成花葶(以帶腋芽的花梗節(jié)段為材料誘導(dǎo)花葶,可獲得較多的不定芽誘導(dǎo)起始材料[44]);在高溫條件(高于28℃)下培養(yǎng)易形成營養(yǎng)芽[29,45-47]。王冬云等[38]利用黃花蝴蝶蘭的花梗腋芽為外植體,進行誘導(dǎo),增殖倍數(shù)最高可達12倍,代容春等[48]以蝴蝶蘭無菌幼苗(株高約1.5cm)為外植體,用MS、1/2MS、White、B5培養(yǎng)基進行培養(yǎng),結(jié)果表明,以1/2MS促進分株最為明顯。在細胞分裂素與生長素的配比中,6-BA與NAA、IBA或IAA配比均能誘導(dǎo)分株增殖,尤以6-BA與NAA配比分株效果為佳。對6-BA與NAA的配比進行研究發(fā)現(xiàn),6-BA濃度過高、過低均不利于分株增殖;NAA 則要求較低的濃度。

潘學(xué)峰等[29]以蝴蝶蘭的滿天紅品種為材料,取已開花的花梗,選其下端休眠芽作為外植體進行叢生芽誘導(dǎo),結(jié)果表明,隨著6-BA濃度的不斷增加,新增的芽數(shù)也隨之不斷增多,增殖的倍數(shù)不斷提高。但單獨使用生長素不能使外植體誘導(dǎo)出叢生芽,只有在生長素和細胞分裂素同時存在時,才能誘導(dǎo)出叢生芽,其中以6-BA 12.5mg/L+NAA 0.05mg/L的處理組合效果最佳,增殖倍數(shù)可達3.00倍,所誘導(dǎo)出的叢生芽不僅生長健壯,而且顏色鮮嫩,有利于進一步增殖與培育壯苗。而當(dāng)6-BA濃度高于15.0mg/L時,雖然誘導(dǎo)的叢生芽倍數(shù)不斷增加,但所長出的叢生芽生長瘦弱,甚至有些還有畸形現(xiàn)象,不利于進一步增殖與培育壯苗。同時,在增殖階段發(fā)現(xiàn)采用接雙芽比接單芽的增殖效果好,發(fā)生側(cè)芽的速度快且整齊健壯,可能是蝴蝶蘭叢芽的發(fā)生也具有群體效應(yīng)。

林宗鏗等[47]研究表明,叢生芽的增殖率隨6-BA濃度的增加而增加;同時,誘導(dǎo)芽的個體也隨濃度的增加而變的細小。有關(guān)去莖尖對芽繁的影響試驗結(jié)果表明,去掉莖尖的芽增殖率要明顯的高于對照,這可能是由于去掉頂端優(yōu)勢,有利于誘導(dǎo)叢生芽。在添加附加物方面,代容春等[48]研究表明,椰子汁使增殖系數(shù)達 6.1,植株生長良好,根多,植株旺盛,而水解乳蛋白、水解酪蛋白及酵母汁均不能促進分株增殖,反而有輕微抑制的作用。

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