劉向華

高中生物人教版新課標(biāo)教材《選修3·現(xiàn)代生物科技專題》中的“基因表達(dá)載體的構(gòu)建”，是基因工程的基本操作程序中的第二步，也是基因工程的核心。

基因表達(dá)載體由目的基因(插入基因)、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因(抗生素基因)等組成。教師要引導(dǎo)學(xué)生認(rèn)識(shí)：?jiǎn)?dòng)子是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端；終止子位于基因的尾端，也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA短片段；抗生素基因作為其標(biāo)記基因。

基因表達(dá)載體構(gòu)建的目的是為了使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能表達(dá)和發(fā)揮作用；啟動(dòng)子的作用是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，通過(guò)翻譯過(guò)程，最終獲得所需要的蛋白質(zhì)；終止子使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止下來(lái)；標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)。

1基因表達(dá)載體中的啟動(dòng)子、終止子是目的基因帶有的，還是質(zhì)粒上固有的

將供體生物的基因轉(zhuǎn)移到受體生物的細(xì)胞中，只有使用生物自身基因的啟動(dòng)子、終止子才能比較利于基因的表達(dá)。如果目的基因是從自然界中已有的物種中分離出來(lái)的，在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，不需要在質(zhì)粒的目的基因前接上特定的啟動(dòng)子、終止子，目的基因中已含有啟動(dòng)子、終止子；如果目的基因是通過(guò)人工方法合成的，或通過(guò)cDNA文庫(kù)獲得的，則目的基因是不含啟動(dòng)子和終止子的，只將基因的編碼序列導(dǎo)入受體生物中。目的基因中沒(méi)有啟動(dòng)子、終止子，是無(wú)法轉(zhuǎn)錄的，因此，在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，由于質(zhì)粒上不含有目的基因的啟動(dòng)子、終止子，所以需要在與質(zhì)粒結(jié)合之前，在目的基因的前后端接上特定的啟動(dòng)子、終止子。

2標(biāo)記基因是質(zhì)粒上固有的，還是后加上去的

目的基因是否導(dǎo)入受體生物中還需要有標(biāo)記基因作為篩選標(biāo)記。一般情況下，質(zhì)粒載體在基因組中有1—2個(gè)篩選標(biāo)記，為寄主細(xì)胞提供易于檢測(cè)的表型特征。由于構(gòu)建載體的目的不同，需要的標(biāo)記基因也不同，有的標(biāo)記基因是質(zhì)粒上固有的，有的標(biāo)記基因是需要另外加上的，例如有時(shí)需要確定目的基因表達(dá)的產(chǎn)物存在于細(xì)胞的什么部位，往往要加上可以標(biāo)識(shí)存在部位的基因(或做成目的基因與標(biāo)識(shí)基因的融合基因)，如綠色熒光蛋白基因等。

3相關(guān)訓(xùn)練

圖1為某種質(zhì)粒表達(dá)載體簡(jiǎn)圖，小箭頭所指分別為限制性內(nèi)切酶EeoRI、BamHI的酶切位點(diǎn)，ampr為青霉索抗性基因，tctR為四環(huán)素抗性基因，P為啟動(dòng)因子，T為終止子，orj為復(fù)制原點(diǎn)。已知目的基因的兩端分別有包括EcoRI、BamHI在內(nèi)的多種酶的酶切位點(diǎn)。

(1)將含有目的基因的DNA與質(zhì)粒表達(dá)載體分別用EcoRI酶切，酶切產(chǎn)物用DNA連接酶進(jìn)行連接后，其中由兩個(gè)DNA片段之間連接形成的產(chǎn)物有

、

、

3種。若要從這些連接產(chǎn)物中分離出重組質(zhì)粒，需要對(duì)這些連接產(chǎn)物進(jìn)行

(2)用上述3種連接產(chǎn)物與無(wú)任何抗藥性的原核宿主細(xì)胞接種到含四環(huán)的培養(yǎng)基中，能生長(zhǎng)的原核宿主細(xì)胞所含有的連接產(chǎn)物是

。

(3)目的蓮因表達(dá)時(shí)，RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)是

，其合成的產(chǎn)物是

。

(4)在上述實(shí)驗(yàn)中，為了防止目的基因和質(zhì)粒表達(dá)載體在酶切后產(chǎn)生的末端發(fā)生任意連接，酶切時(shí)應(yīng)選用的酶是

。

解析：基因工程中，一個(gè)重要的工具是限制性內(nèi)切酶，因?yàn)槿庋劭床灰?，所以學(xué)生理解起來(lái)有很大難度。應(yīng)通過(guò)課本中的典型圖解分析，幫助學(xué)生理解。

由基因操作的基本步驟可知，對(duì)于運(yùn)載體——質(zhì)粒，用限制酶切割一次，形成2個(gè)黏性末端，斷開了兩個(gè)化學(xué)鍵；目的基因從原來(lái)的DNA分子上被切下來(lái)，形成了2個(gè)黏性末端，但需斷裂4個(gè)化學(xué)鍵。如果目的基因和質(zhì)粒用同一種限制性內(nèi)切酶來(lái)切割，則產(chǎn)生的黏性末端相同，這樣用DNA連接酶連接時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生三種產(chǎn)物：目的基因——目的基因、質(zhì)粒——質(zhì)粒、目的基因——質(zhì)粒。

變通來(lái)想，要想只得到目的基因——質(zhì)粒這種產(chǎn)物，應(yīng)讓二者兩端的黏性末端完全不同，則只有一種連接方式，則此時(shí)應(yīng)用2種不同的酶來(lái)分別切割目的基因的兩端。

參考答案：(1)目的基因——載體連接物

載體——載體連接物目的基因——目的基因連接物分離純化

(2)載體——載體連接物

目的基因——載體連接物載體——載體連接物

(3)啟動(dòng)子mRNA

(4)EcoRI和BamHI