王裕玉，徐跑，聶志娟，華忠， 李全杰，邵乃麟，徐鋼春

中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點實驗室，江蘇 無錫214081

池塘養(yǎng)殖是淡水養(yǎng)殖的主要方式。2017年我國池塘養(yǎng)殖面積2527.78千公頃，占淡水養(yǎng)殖總面積的47.12%，養(yǎng)殖產(chǎn)量2122.22萬噸，占淡水養(yǎng)殖總產(chǎn)量的73.05%[1]，為優(yōu)化居民膳食結(jié)構(gòu)、調(diào)整產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)、增加漁民收入、保障糧食安全并帶動相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展等方面做出了重要貢獻。然而，池塘養(yǎng)殖仍以“進水渠+養(yǎng)殖池塘+排水渠”為主要形式[2]，這種養(yǎng)殖模式的發(fā)展是以高放養(yǎng)密度、高投喂量、高勞動力成本、高能耗且犧牲環(huán)境為代價換來的。養(yǎng)殖尾水造成的環(huán)境負荷已成為制約淡水池塘養(yǎng)殖發(fā)展的主要瓶頸，此外，還存在抗生素濫用引起細菌耐藥性增加、微生物區(qū)系遭到破壞和水產(chǎn)品質(zhì)量安全等問題[3,4]。

池塘工程化循環(huán)水養(yǎng)殖是近幾年來我國漁業(yè)轉(zhuǎn)型升級、創(chuàng)新發(fā)展的一種新模式，與傳統(tǒng)池塘養(yǎng)殖模式相比，新模式在工藝理念、技術(shù)裝備和養(yǎng)殖方式等方面都有了重大革新。工程化循環(huán)水養(yǎng)殖是指利用占池塘面積2%～5%的水面建設(shè)具有氣提推水增氧、自動投餌系統(tǒng)和集排污裝備的系列水槽作為養(yǎng)殖區(qū)進行類似于“工廠化”的高密度養(yǎng)殖，實施智能化在線監(jiān)測、工業(yè)化管理，并對其余95%～98%的水面進行適當(dāng)改造后作為凈化區(qū)對養(yǎng)殖尾水進行生物凈化處理，能構(gòu)建良好生境，實現(xiàn)養(yǎng)殖尾水的零排放和綜合養(yǎng)殖效益增收的目標。目前有關(guān)池塘工程化循環(huán)水養(yǎng)殖模式的研究主要集中在系統(tǒng)建設(shè)優(yōu)化、養(yǎng)殖品種篩選等方面，而關(guān)于高密度養(yǎng)殖條件下養(yǎng)殖對象生長適應(yīng)情況及配套技術(shù)的研究尚屬空白。大量研究表明，養(yǎng)殖密度作為一種脅迫因子，會對魚類行為、內(nèi)分泌、生長發(fā)育、代謝及免疫力等生理機能產(chǎn)生影響，最終會影響魚類福利、產(chǎn)量和養(yǎng)殖效益，這主要與擁擠脅迫引發(fā)魚類的應(yīng)激反應(yīng)、抗氧化、抗病能力和水質(zhì)的改變相關(guān)[5～8]。因此，研究不同養(yǎng)殖密度條件下魚類的生理反應(yīng)機制，有助于在生產(chǎn)實踐中掌握適宜的養(yǎng)殖密度，提高養(yǎng)殖效益和環(huán)境效益。

吉富羅非魚“中威1號”是采用被動整合雷達標記(PIT)技術(shù)、數(shù)量遺傳學(xué)最佳線性無偏預(yù)測(BLUP)分析和家系選育等綜合育種新技術(shù)，經(jīng)過多年多代培育而成，具有生長速度快、出肉率高、病害少、易馴化、起捕率高等優(yōu)點[9]，已成為我國出口創(chuàng)匯的重要水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一，具有很高的經(jīng)濟價值。本研究探討了池塘工程化循環(huán)水養(yǎng)殖模式下不同養(yǎng)殖密度對吉富羅非魚生長及生理指標的影響，旨在了解吉富羅非魚在密度脅迫條件下的響應(yīng)，為工程化循環(huán)水養(yǎng)殖技術(shù)的推廣與示范提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗條件

養(yǎng)殖試驗在中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心揚中基地改性PVC鋼架流水槽內(nèi)進行。流水槽分為氣提推水增氧區(qū)、養(yǎng)殖區(qū)(22m×5m×2.5m，水深2.0m)和集污區(qū)。流水槽前端安裝氣提推水增氧裝置；養(yǎng)殖區(qū)底部安裝增氧設(shè)施；集污區(qū)設(shè)有軌道式吸污裝置。采用凈化區(qū)水下放養(yǎng)白鰱、花鰱和鱖魚，水上種植水葫蘆及吊養(yǎng)珍珠蚌的組合方式進行水質(zhì)調(diào)控。養(yǎng)殖水源為長江水，水質(zhì)清新、無污染，符合《漁業(yè)水質(zhì)標準》。

1.2 試驗設(shè)計與養(yǎng)殖管理

試驗開始前，將中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心宜興養(yǎng)殖基地繁育的吉富羅非魚“中威1號”苗種暫養(yǎng)于土池中。將體質(zhì)健康、規(guī)格一致的魚苗(初始平均體質(zhì)量為6.25g)隨機分組。試驗設(shè)置3 個處理，分別為低密度組(LSD)、中密度組(MSD)和高密度組(HSD)，各密度組的初始放養(yǎng)量分別為10000、20000、30000 尾/槽，初始養(yǎng)殖密度分別為45、90、136尾/m3，每個處理組設(shè)2個重復(fù)，暫養(yǎng)2d后開始投喂。試驗期間，投喂羅非魚浮性膨化飼料(飼料粗蛋白28%，嘉吉飼料(鎮(zhèn)江)有限公司)，飼料粒徑根據(jù)魚體生長適時調(diào)整。每天投喂3次(6：00、11:00和17：00)，按體質(zhì)量的2%～5%進行投喂，具體投喂量根據(jù)攝食、水溫、天氣變化等情況調(diào)整。投飼時確保飼料不漂出流水槽，每次投飼時長約為30min，以觀察上浮搶食魚數(shù)量明顯減少時即可。養(yǎng)殖全程凈化區(qū)不投飼。試驗期間，水流速度約為3cm/s，水溫24.0～31.8℃，溶解氧3.01～7.18mg/L，pH 7.68～8.27，氨氮0.19～0.86mg/L。試驗周期為80d。

1.3 樣品采集

分別于試驗第20、50、80天取樣。每次每槽隨機取20尾魚，首先用200mg/L MS-222將試驗魚麻醉，測量體質(zhì)量和體長等指標。然后，尾靜脈取血，將血液注入到1.5mL離心管中，4℃冰箱中靜置4h，4000r/min離心15min，將血清轉(zhuǎn)入離心管中，-80℃保存，待測。采血完成后，迅速解剖，取肝臟等組織，液氮中速凍，轉(zhuǎn)入-80℃保存，用于后續(xù)分析。

按照文獻[10]的方法計算增重率(WG)、特定生長率(SGR)、肥滿度(CF)、肝體指數(shù)(HSI)和內(nèi)臟指數(shù)(VSI)。

1.4 樣品分析

采用全自動生化分析儀(邁瑞B(yǎng)S-400，深圳)測定血清總蛋白(TP)、總膽固醇(TC)、血糖(Glu)、甘油三酯(TG)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)含量等血清生化指標；采取酶聯(lián)免疫檢測法(ELISA)測定血清皮質(zhì)醇、超氧化物歧化酶(SOD)和溶菌酶含量。

抗氧化指標：測定前，肝臟樣品在4℃冰箱中解凍，用預(yù)冷的0.86%生理鹽水洗滌，擦干表面水分，準確稱取肝臟重量，按照重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入9倍體積的生理鹽水，高速勻漿，勻漿液經(jīng)離心(4℃，3000r/min，10min)后，取上清液，-80℃保存用于測定肝臟抗氧化酶活性。使用酶標儀(Synergy H1,Bio-Tek，美國)測定總超氧化物歧化酶(T-SOD)、過氧化氫酶(CAT)、總抗氧化能力(T-AOC)活性及丙二醛(MDA)含量等指標。采用考馬斯亮藍法測定肝臟蛋白含量。采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進行測定，具體方法參照試劑盒說明書。

1.5 統(tǒng)計分析

采用SAS 9.1.2統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。先作單因素方差分析(ANOVA)，若各處理之間差異顯著，再作Duncan’s多重比較，P<0.05表示差異顯著。試驗結(jié)果采用“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 池塘工程化循環(huán)水模式下養(yǎng)殖密度對吉富羅非魚生長性能和內(nèi)臟指數(shù)的影響

在整個試驗周期內(nèi)，吉富羅非魚很快即適應(yīng)了膨化飼料和流水槽環(huán)境，具有集群搶食的特點，攝食能力較強，未發(fā)生病害和明顯死亡。不同養(yǎng)殖密度對吉富羅非魚生長性能的影響結(jié)果見表1。結(jié)果表明，試驗20d后，各密度組吉富羅非魚平均體重、增重率(WG)和特定生長率(SGR)差異不顯著(P>0.05)；50d后，高密度組平均體重、WG、SGR顯著低于低密度組和中密度組(P<0.05)。80d后，低密度組平均體重、WG、SGR顯著高于中、高密度組(P<0.05)，而中、高密度組之間差異不顯著(P>0.05)。

20d后，各密度組吉富羅非魚肥滿度(CF)差異不顯著(P>0.05)；而在50d和80d后，低密度組魚CF顯著高于其他2組P<0.05。50d后，內(nèi)臟指數(shù)(VSI)隨著養(yǎng)殖密度增加而顯著降低(P<0.05)；而20d和80d后，VSI在各密度組之間差異不顯著(P>0.05)。養(yǎng)殖密度對HSI無顯著影響。

表1 池塘工程化循環(huán)水模式下不同養(yǎng)殖密度下吉富羅非魚的生長性能和內(nèi)臟指數(shù)

注：同行數(shù)據(jù)后肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)。數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差表示。表2同。

2.2 池塘工程化循環(huán)水模式下養(yǎng)殖密度對吉富羅非魚血清生化指標的影響

養(yǎng)殖密度對血清ALT、AST、ALP、TC、SOD、皮質(zhì)醇和溶菌酶含量無顯著影響(P>0.05)。20d后，吉富羅非魚血清TP和TG含量在各組之間差異不顯著(P>0.05)；而在50d和80d后，低密度組試驗魚血清TP和TG含量顯著高于中、高密度組(P<0.05)。80d后，高密度組試驗魚血清Glu含量顯著高于其他密度組(P<0.05)；20d和50d后，各密度組試驗魚Glu含量差異不顯著(P>0.05)(表2)。

表2 池塘工程化循環(huán)水模式下不同養(yǎng)殖密度下吉富羅非魚的血清生化指標

2.3 池塘工程化循環(huán)水模式下養(yǎng)殖密度對吉富羅非魚抗氧化指標的影響

表3的結(jié)果顯示，養(yǎng)殖密度對吉富羅非魚肝臟CAT、T-SOD、T-AOC活性和MDA含量的影響不顯著(P>0.05)。

3 討論

3.1 養(yǎng)殖密度對吉富羅非魚生長性能的影響

魚類的生長受遺傳、激素等內(nèi)源性因素和食物豐度和可消化性、養(yǎng)殖密度、環(huán)境條件等外源性因素的影響。當(dāng)養(yǎng)殖密度適宜時，魚類健康、生長率和飼料效率高，然而高密度養(yǎng)殖時，魚類受到許多因素單獨或疊加影響生長。魚類會通過改變一系列內(nèi)在的生理狀態(tài)來適應(yīng)高密度脅迫，但是當(dāng)脅迫超過其自身調(diào)節(jié)能力時，魚類生理功能出現(xiàn)紊亂，最終生長緩慢，甚至患病死亡[7,11～15]。本研究中，吉富羅非魚很快就適應(yīng)了膨化飼料和流水槽養(yǎng)殖環(huán)境，養(yǎng)殖期間未發(fā)生病害和明顯死亡。試驗的前20d，養(yǎng)殖密度對吉富羅非魚生長無顯著影響，而在養(yǎng)殖后期，高密度養(yǎng)殖組魚生長顯著降低。類似地，Papoutsoglou等[16]對虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、Liu等[17]對大菱鲆(Scophthalmusmaximus)和程佳佳等[18]對雜交鱘[Acipenserbaerii(♀)×Acipenserschrenckii(♂)]的研究均發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖初期養(yǎng)殖密度不會影響魚類的生長、攝食和飼料利用，而在養(yǎng)殖后期高密度組魚類生長率降低。高養(yǎng)殖密度抑制魚類生長的原因可歸結(jié)于以下3點：一是高密度養(yǎng)殖引起的水質(zhì)惡化，主要是通過魚類的代謝性排泄導(dǎo)致有機負荷和氨氮過高、溶解氧水平降低，從而損害生長[19,20]，提高水中溶解氧水平可減少高密度養(yǎng)殖對魚類的負面影響[21]；本研究中，水質(zhì)參數(shù)均在羅非魚養(yǎng)殖水質(zhì)推薦值范圍內(nèi)，魚類沒有受到水質(zhì)的脅迫影響；二是與低攝食量和種群競爭關(guān)系加劇有關(guān)[22～24]；三是高密度養(yǎng)殖引起應(yīng)激反應(yīng)，魚類需要消耗更多的能量來應(yīng)對脅迫，以維持正常的生理代謝。與之相反的是，對虹鱒[19]、歐洲鱸魚(Dicentrarchuslabrax)[25,26]和塞內(nèi)加爾鰨(Soleasenegalensis)[6,27]的研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖密度對其生長和健康無顯著影響；還有研究發(fā)現(xiàn)，低養(yǎng)殖密度也會對魚類的生長產(chǎn)生抑制效應(yīng)[28～30]，這可能與魚類的集群行為、活動范圍大、覓食等活動耗能增多有關(guān)[22]。不同研究者得出不同的結(jié)論可能與魚的種類、生長階段、養(yǎng)殖密度水平、飼料利用率、養(yǎng)殖周期和養(yǎng)殖環(huán)境條件的差異有關(guān)。

表3 池塘工程化循環(huán)水模式下不同養(yǎng)殖密度下吉富羅非魚的抗氧化指標

3.2 養(yǎng)殖密度對吉富羅非魚血清生化指標的影響

血液指標與其代謝、營養(yǎng)及健康狀況有著密切的聯(lián)系。當(dāng)魚體受到外界因子的影響而發(fā)生病理性變化時會在血液指標中表現(xiàn)出來，因此血液指標被廣泛地用于評價魚類的健康、營養(yǎng)和對環(huán)境的適應(yīng)狀況，為防治方案提供有價值的信息[31]。本研究中，不同養(yǎng)殖密度組吉富羅非魚血清皮質(zhì)醇水平無顯著差異，對尼羅非魚(Oreochromisniloticus)[7]、歐洲鰉(Husohuso)[12]、虹鱒[19,24]、歐洲鱸魚[30]和塞內(nèi)加爾鰨[27]的研究中也得到了類似的結(jié)果。這些結(jié)果表明，魚類對長期的擁擠脅迫形成了適應(yīng)，皮質(zhì)醇水平輕微變化或未發(fā)生變化，血清皮質(zhì)醇可能不適合作為魚類長期應(yīng)激的敏感信號[23，24]。相反地，在一些研究中發(fā)現(xiàn)，高密度養(yǎng)殖組魚類血清皮質(zhì)醇水平明顯升高[11,26,32，33]，這是由于擁擠應(yīng)激會激活下丘腦-垂體-腎間軸(HPI)而產(chǎn)生皮質(zhì)醇[34]，高皮質(zhì)醇水平會對生長和免疫反應(yīng)產(chǎn)生有害影響[5,35]。Millán-Cubillo等[30]和Procarione等[36]研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖密度跟血清皮質(zhì)醇水平呈負相關(guān)關(guān)系。養(yǎng)殖密度與血清皮質(zhì)醇的關(guān)系存在差異有多方面的原因。例如，當(dāng)魚類處于急性應(yīng)激狀態(tài)時，禁食組的血清皮質(zhì)醇含量高于攝食組[26,37]，皮質(zhì)醇含量可作為魚類急性應(yīng)激時的指標。SOD和溶菌酶作為非特異性免疫因子，在魚類的免疫應(yīng)答和抗病力方面起著重要作用[38]，魚類可以通過增加溶菌酶或補體水平、提高免疫水平以應(yīng)對應(yīng)激[39，40]。本研究中，血清SOD和溶菌酶含量在各密度組之間無顯著差異，表明養(yǎng)殖密度對免疫應(yīng)答無直接影響。試驗前期，未發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖密度對血清TP、TC、Glu、TG含量有影響，而在養(yǎng)殖后期，高密度組Glu含量升高、TG含量降低，這與Telli等[7]對羅非魚、Andrade等[27]對塞內(nèi)加爾鰨、Naderi等[24]對虹鱒的研究結(jié)果相似，這可能是由于魚類在慢性應(yīng)激過程中，能夠動員糖異生和糖原分解以滿足其在擁擠脅迫時對能量需求的增加[41，42]。

3.3 養(yǎng)殖密度對吉富羅非魚抗氧化酶活性的影響

集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖中氧化應(yīng)激是不可避免的一個問題，當(dāng)魚體受到有害刺激時抗氧化系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致代謝紊亂，最終會影響魚類的生長、抗病能力、健康和漁產(chǎn)品品質(zhì)。在應(yīng)激條件下，活性氧(ROS)在生物體內(nèi)產(chǎn)生并迅速積累，過量的ROS會引起基因表達和細胞的氧化還原狀態(tài)改變，導(dǎo)致抗氧化酶的損失并引發(fā)脂質(zhì)過氧化[27,43]。本研究結(jié)果顯示，肝臟CAT、T-SOD、T-AOC和MDA水平在不同養(yǎng)殖密度組之間沒有差異，這表明高養(yǎng)殖密度不會引起吉富羅非魚組織氧化損傷和脂質(zhì)過氧化。類似地，Andrade等[27]在對塞內(nèi)加爾鰨的研究中也得到了類似的結(jié)果。相反地，Liu等[17]對大菱鲆的研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖后期高密度組魚肝臟SOD、CAT和GSH-Px水平明顯降低?？寡趸富钚缘慕档涂赡苁囚~類對持續(xù)擁擠脅迫的一種響應(yīng)，同時也反映了魚類抗氧化系統(tǒng)清除有害超氧自由基的能力有限，最終導(dǎo)致氧化損傷[6,27]。

4 結(jié)語

綜上所述，池塘工程化循環(huán)水養(yǎng)殖模式條件下，高養(yǎng)殖密度可影響吉富羅非魚生長性能，但對其抗氧化活性、某些生理和免疫參數(shù)無顯著影響，該研究結(jié)果有助于監(jiān)測池塘工程化循環(huán)水養(yǎng)殖吉富羅非魚的生長、健康和福利狀況。從生長、福利和經(jīng)濟效益等方面考慮，建議池塘工程化循環(huán)水養(yǎng)殖吉富羅非魚(初始體重6.25g)的密度為90尾/m3。