俞伏松

摘要從臨床表現(xiàn)胸腿肌出血、法氏囊腫大出血為主要特征的病死雞肝脾和法氏囊中分離到1株病毒(IBDV-FJ)。結(jié)果表明,該分離病毒無(wú)血凝性,在瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)中能與抗IBDV特異性血清出現(xiàn)1條清晰的白色沉淀線;人工感染28日齡雛雞出現(xiàn)與臨床一致的病變,并回收到病毒;應(yīng)用針對(duì)IBDV VP3基因的特異性引物進(jìn)行RT-PCR,能擴(kuò)增到長(zhǎng)度為1 041bp的特異性目的片段;序列分析發(fā)現(xiàn)分離毒VP3基因與IBDV超強(qiáng)毒和經(jīng)典毒株的核苷酸同源性分別為97.7%～98.2%和95.2%。初步鑒定該分離毒為雞傳染性法氏囊病病毒超強(qiáng)毒株。

關(guān)鍵詞雞傳染性法氏囊病病毒;超強(qiáng)毒株;分離;鑒定

中圖分類號(hào)S851.34+7.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào) 1007-5739(2009)11-0218-02

傳染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD)是1種危害幼齡雞的急性、高度接觸性免疫抑制性傳染病,3～6周齡雛雞最易感,7日齡內(nèi)雛雞感染可引起嚴(yán)重的免疫抑制,導(dǎo)致感染雞對(duì)其他疫苗的免疫失敗。1979年在我國(guó)北京郊區(qū)發(fā)現(xiàn)該病[1];1980年周蛟等從北京進(jìn)口的雞群中分離到IBD-CJ801株[2],隨后全國(guó)各地陸續(xù)有該病發(fā)生和流行的報(bào)道;1985年,在美國(guó)Delmarve家禽生產(chǎn)地區(qū)發(fā)現(xiàn)了1個(gè)變異株,它能逃脫標(biāo)準(zhǔn)疫苗株母源抗體的保護(hù);1989年,Ch- ettle等在荷蘭分離出高致病力的IBDV毒株(very virulent inf ectious bursal disease virus,vvIBDV);近年來(lái)國(guó)內(nèi)也報(bào)道了vvIBDV的流行[3-6]。

2007年福建省某雞場(chǎng)35日齡2 000多羽免疫雞群突然發(fā)病死亡,發(fā)病率和死亡率分別達(dá)73%和52%,剖檢變化主要為胸肌和腿肌條狀出血;法氏囊明顯腫大為正常法氏囊的2~4倍,有的外觀呈紫葡萄狀,切開(kāi)后可見(jiàn)內(nèi)側(cè)皺褶面出血,有的可見(jiàn)干酪樣物質(zhì)或炎性分泌物,腎腫脹、尿酸鹽沉積,脾臟腫大,表面斑駁。經(jīng)免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè),初步診斷為雞傳染性法氏囊病。故無(wú)菌采集病雞法氏囊、肝脾等組織進(jìn)行病毒分離與鑒定,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物和血清

9～10日齡SPF雞胚購(gòu)自福建省生藥廠;28日齡雛雞為非免疫健康雞并經(jīng)AGP檢測(cè)母源抗體陰性;抗IBDV陽(yáng)性血清購(gòu)自中監(jiān)所;抗IBDV單抗由福建省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物病毒研究室提供。

1.2受體菌、質(zhì)粒載體和主要試劑

E.coil JM109菌株由福建省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物病毒研究室提供;T4DNA連接酶、pMD18-T載體、鼠源反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)、RNA酶抑制劑(RNasin)、rTaq聚合酶、Trizol試劑盒購(gòu)自寶生物工程有限公司(大連);DNA膠回收試劑盒與質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖芯?gòu)自上海生工生物工程有限公司。

1.3病毒分離

1.3.1病料采集與處理。無(wú)菌采集具典型病變的病死雞法氏囊及肝脾,加Hanks制成20%勻漿,凍融3次,4 000rpm離心15min,取上清液加青霉素、鏈霉素各1 000IU/mL,置4℃冰箱中過(guò)夜處理備用。

1.3.2雞胚接種。取上清液,經(jīng)絨毛尿囊膜接種9～10日齡SPF雞胚,每胚0.2mL。收集48～120h的死胚尿囊液和胚膜混合勻漿,離心取上清液即為分離毒記IBDV-FJ。

1.4病毒鑒定

1.4.1人工感染試驗(yàn)。分離毒經(jīng)點(diǎn)眼、滴鼻接種28日齡雛雞4只,每只0.2mL,同時(shí)以健康雛雞為對(duì)照,隔離飼養(yǎng)。觀察發(fā)病死亡情況,并收集病死雞法氏囊,用于制備AGP抗原和回收病毒。

1.4.2AGP抗原制備。采集人工感染病死雞法氏囊,用生理鹽水作1∶4勻漿處理,置冰箱中凍融3次,離心,取上清液即為分離毒AGP抗原。

1.4.3瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。制備厚3mm 1%瓊脂(含8%NaCl)平板,按常規(guī)打孔,中央孔加標(biāo)準(zhǔn)抗IBDV陽(yáng)性血清,周?chē)准臃蛛x毒AGP抗原,置濕盒中37℃過(guò)夜,觀察結(jié)果。

1.4.4免疫熒光試驗(yàn)。取臨床采集或人工感染病死雞法氏囊制成6μm厚的冰凍切片,用冷丙酮固定10min,加抗IBDV單抗,置濕盒中37℃ 30min,再加FITC標(biāo)記的羊抗鼠-IgG 30min,洗滌后以甘油-PBS封片。熒光顯微鏡下觀察,以出現(xiàn)亮綠色熒光病灶判定為陽(yáng)性。

1.4.5分離毒VP3基因RT-PCR鑒定。①引物的設(shè)計(jì)與合成。根據(jù)GenBank上已公布的vvIBDV VP3基因序列,用OLIGO 6.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物:Pl:5′-CAGCTTGCATGC CTGCAGG-3′;P2:5′-AACCTGATTACGAATTCGAGCT CG-3′,兩引物位于IBDV VP3基因首末端保守區(qū),擴(kuò)增產(chǎn)物約為1 041bp,由寶生物工程有限公司(大連)合成。②RNA提取。取250μL病毒液加入750μL Trizol RNA提取液,混勻,室溫放置15min。加入200μL氯仿,振蕩混勻,4℃ 12 000 rpm離心15min。取上清加入500μL異丙醇,室溫放置10 min,12 000rpm離心10min。棄上清,75%乙醇除鹽,倒置濾紙上吸掉剩余液體,干燥后懸于25μL的DEPC水中,備用。③cDNA合成。取8μL病毒RNA,加入上下游引物P1P2各1μL,100℃熱吸附10min,立即置于冰上10min,繼續(xù)加入5×first Standing Buffer 4μL、2.5Mm dNTPs 2μL、0.1mM DTT 2μL、M-MLV 1μL、Rnasin 1μL,37℃溫育2h,取出后置4℃保存?zhèn)溆?。④PCR擴(kuò)增。取制備好的cDNA 4μL作模板,加入上下游引物P1P2各1μL、2.5mM dNTPs 8μL、10×buffer 10μL、rTaq 1μL、滅菌水75μL,反應(yīng)體系為100μL。在PCR擴(kuò)增儀內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增條件為:95℃預(yù)變性5min,94℃變性1min、52℃復(fù)性1min、72℃延伸2min,35個(gè)循環(huán),72℃ 10min。結(jié)束后取PCR產(chǎn)物4μL,在1%瓊脂凝膠上電泳。

1.4.6擴(kuò)增產(chǎn)物序列測(cè)定。應(yīng)用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物,與pMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)化E.coil JM109,篩選并經(jīng)PCR鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒,選取陽(yáng)性重組質(zhì)粒由大連寶生物工程有限公司測(cè)序。

1.5同源性比較

采用DNAStar軟件對(duì)分離毒擴(kuò)增產(chǎn)物(VP3基因)與GenBank中的登錄IBDV不同毒株進(jìn)行核苷酸序列比較,選取的毒株分別是:超強(qiáng)毒為SH95(AY134874)、OKYM(D49 706)、UK661(X92760),弱毒株為JD1(AF321055),經(jīng)典毒株為52/70(D00869),變異株為GLS(M97346)。

2 結(jié)果與分析

2.1病毒分離

雞胚接種48～120h后陸續(xù)死亡,胚體充血,絨毛尿囊膜水腫增厚,尿囊液清亮。

2.2分離毒部分特性鑒定

2.2.1血凝試驗(yàn)。IBDV-FJ不凝集雞和鴿子的紅細(xì)胞,無(wú)血凝性,排除了雞新城疫和禽流感。

2.2.2人工感染試驗(yàn)。分離毒接種28日齡雛雞后72h,陸續(xù)出現(xiàn)精神不振、羽毛蓬松、接種后4d出現(xiàn)死亡,剖檢出現(xiàn)與臨床一致的病變,并回收到病毒。

2.2.3瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。分離毒AGP抗原與抗IBDV陽(yáng)性血清之間出現(xiàn)1條清晰的白色沉淀線,表明被檢抗原為IBDV。

2.2.4免疫熒光試驗(yàn)。臨床采集和人工感染發(fā)病雞法氏囊的冰凍切片與IBDV單抗作用后,在熒光顯微鏡下均觀察到亮綠色熒光病斑。

2.2.5RT-PCR鑒定。對(duì)提取的病毒RNA進(jìn)行RT-PCR,擴(kuò)增得到包含VP3基因全長(zhǎng)的特異性目的片段長(zhǎng)度約1 041bp,在1%瓊脂糖凝膠電泳中分離毒PCR產(chǎn)物出現(xiàn)與IBDV陽(yáng)性對(duì)照大小一致的條帶(如圖1)。

2.3VP3全基因序列同源性比較

利用DNAstar分析軟件進(jìn)行序列拼接并經(jīng)BLAST分析,結(jié)果分離毒的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為1 041bp,包含870bp 的VP3全基因序列,其A、T、G、C等4種堿基的比例分別為28.9%、14.9%、26.4%、29.8%,共編碼290個(gè)氨基酸。將IBDV-FJ VP3基因與GeneBank中已登錄IBDV不同毒株進(jìn)行同源性比較,可見(jiàn)分離毒VP3基因與IBDV 3株超強(qiáng)毒(SH95、OKY M、UK661)和經(jīng)典毒株(52/70)的核苷酸同源性分別為97.7%～98.2%和95.2%(見(jiàn)表1),初步表明該分離毒為IBDV超強(qiáng)毒株。

3結(jié)論與討論

(1)本研究從福建省某發(fā)病雞場(chǎng)中疑似傳染性法氏囊病的病雞中分離到1株IBDV毒株(IBDV-FJ),該分離毒無(wú)血凝性,在瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)中能與抗IBDV特異性血清出現(xiàn)1條清晰的白色沉淀線;人工感染28日齡雛雞出現(xiàn)與臨床一致的病變,并回收到病毒;應(yīng)用針對(duì)IBDV VP3基因的特異性引物進(jìn)行RT-PCR,能擴(kuò)增到長(zhǎng)度為1 041bp的特異性目的片段,包含870bp的VP3全基因序列;序列分析發(fā)現(xiàn)分離毒VP3基因與IBDV超強(qiáng)毒的核苷酸同源性為97.7%～98.2%,差異小于3%;而與經(jīng)典毒株、變異株和弱毒株的同源性為94.9%～95.2%,差異大于4%。

(2)根據(jù)GeneBank中已登錄的IBDV不同毒株VP3基因氨基酸序列,分析并推測(cè)出超強(qiáng)毒株與其他毒力株(弱毒株、傳統(tǒng)毒株和變異株)之間在VP3蛋白氨基酸序列中段存在3個(gè)較保守位點(diǎn)(N23、Y116和E141)和3個(gè)潛在的變異位點(diǎn)[7](超強(qiáng)毒株為D29、V268和A283,其他毒力病毒株為H29、A268和T283)。本研究分離的IBDV-FJ株VP3氨基酸序列N端有1個(gè)位點(diǎn)(D29),C末端氨基酸有2個(gè)位點(diǎn)(V268、A283),具有超強(qiáng)毒特征。初步表明,IBDV-FJ株在VP3蛋白氨基酸序列上具超強(qiáng)毒的分子特征,而非傳統(tǒng)毒力毒株。這為福建省首次報(bào)道。

(3)vvIBDV除引起免疫抑制外,其主要特征是致病力明顯增強(qiáng)、致死率極高。vvIBDV的抗原性與經(jīng)典IBDV疫苗株之間無(wú)差別,這種毒力變異株能夠突破高水平母源抗體,破壞常規(guī)疫苗的保護(hù)作用,不僅能造成體液免疫抑制,而且對(duì)細(xì)胞免疫也有一定的影響。分離毒株人工感染雛雞除引起經(jīng)典毒株相同的病變之外,還引起感染雞的法氏囊呈“紫葡萄樣”外觀、脾臟腫大和胸腺萎縮等病變,與報(bào)道的超強(qiáng)毒株[8,9]引起的病變一致。

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