劉立全 楊劍超 張 衡 楊 菲

摘要介紹了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物原位轉(zhuǎn)基因方法發(fā)展?fàn)顩r、技術(shù)環(huán)節(jié)以及在轉(zhuǎn)化機制上的研究結(jié)果,并對存在的問題以及應(yīng)用前景進行了討論。

關(guān)鍵詞根癌農(nóng)桿菌;植物;遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號 Q943.2 文獻標(biāo)識碼A文章編號 1007-5739(2009)11-0143-01

1根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化原理

野生型根癌農(nóng)桿菌是一種土壤病原細菌,它通過根部傷口侵入植物體,刺激寄主在侵染部位形成冠癭瘤,引發(fā)根癌病。該病在世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生,患病植株株體衰弱,嚴重時整株死亡,在生產(chǎn)上危害極大。冠癭瘤的形成是根癌農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)Ti質(zhì)粒上的一段DNA(T-D NA)轉(zhuǎn)移到植物細胞,整合到染色體組并進行表達的結(jié)果。這種具有天然轉(zhuǎn)基因功能的質(zhì)粒,改造后,在基因工程中可以用作基因轉(zhuǎn)移的載體。根癌農(nóng)桿菌中誘導(dǎo)植物產(chǎn)生腫瘤的質(zhì)粒,簡稱Ti質(zhì)粒。野生型根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒含有2個與致瘤有關(guān)的區(qū)域:一個是T-DNA區(qū),含有致瘤基因;另一個是毒性區(qū),在T-DNA的切割、轉(zhuǎn)移、整合過程起作用,用于植物基因轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒中致瘤基因刪除,并在T-DNA區(qū)域插入適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)記和多克隆位點。

2根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化的特點

2.1導(dǎo)入基因拷貝數(shù)低,表達效果好

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化向植物細胞導(dǎo)入的外源基因拷貝數(shù)大多只有1~3個,而其他方法往往會有幾十個,大量拷貝會導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因的沉默。

2.2轉(zhuǎn)化頻率高

T-DNA鏈在轉(zhuǎn)移過程中受到蛋白質(zhì)的保護及定向作用,可免受核酸酶的降解,從而完整、準(zhǔn)確地進入細胞核,轉(zhuǎn)化效率較高。

2.3導(dǎo)入植物細胞的片段確切,且能導(dǎo)入大片段的DNA

Ti質(zhì)粒上位于2個邊界序列之間的外源基因片段均會轉(zhuǎn)移到植物細胞,可避免其他理化方法將非目的基因片段導(dǎo)入植物細胞而造成潛在遺傳物質(zhì)擴散的危險。

3影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的因素

3.1受體的來源及發(fā)育狀態(tài)

應(yīng)該選擇活躍分裂的功能細胞,如愈傷組織胚性細胞、幼胚等,這些細胞處于良好的脫分化狀態(tài),DNA合成能力強,有利于T-DNA的整合。

3.2農(nóng)桿菌菌株的選擇與質(zhì)粒的構(gòu)建

超毒力的農(nóng)桿菌菌株和超毒雙元載體,能夠增強農(nóng)桿菌的侵染能力和T-DNA的整合能力,較好地克服農(nóng)桿菌對單子葉植物敏感性差的問題。

3.3 vir基因活化物的使用

單子葉植物特別是禾本科植物受傷后分泌的誘導(dǎo)物質(zhì)不足以形成有效的的信號,誘導(dǎo)農(nóng)桿菌vir基因的表達。在共培養(yǎng)的培養(yǎng)基中,添加一定量的酚類化合物,能夠取得良好的效果。

4根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化應(yīng)用范圍與方法的拓展

4.1單子葉植物的轉(zhuǎn)化

最早成功的轉(zhuǎn)化是Bytebier等人用含有nos-nptI基因的重組Ti質(zhì)粒感染石刁柏愈傷組織,并且獲得抗卡那霉素的再生植株。

4.2真菌的轉(zhuǎn)化

Bundock等人成功轉(zhuǎn)化了酵母、木霉、曲霉、鐮孢霉、刺盤孢霉、脈孢霉以及傘菌等多種絲狀亞菌。真菌的成功轉(zhuǎn)化尋找到一種新的真菌基因工程改造方法,可作為研究宿主與T-DNA轉(zhuǎn)化互作關(guān)系的較好的分子體系。

4.3 裸子植物的轉(zhuǎn)化

由于受到外植體培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化和選擇頻率等影響,Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化裸子植物一直受到限制。1999年Wenck等人使用含有附加拷貝virG和(virD+virB)基因的Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化挪威云杉,獲得100多個Gus表達株系,從而建立了裸子植物的轉(zhuǎn)化體系。

5根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化應(yīng)用中存在的問題

5.1轉(zhuǎn)化機理方面

在轉(zhuǎn)化過程中,農(nóng)桿菌本身的分子調(diào)控研究比較深入,但是有關(guān)植物因子的了解尚處于初級階段。此外,農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化過程T-DNA往往是單或者低拷貝整合的原因尚不清楚。

5.2轉(zhuǎn)化策略方面

向植物體內(nèi)導(dǎo)入大片段DNA的工作有待深入,尤其是有重要經(jīng)濟價值的禾谷類和豆科植物大片段DNA轉(zhuǎn)入的研究還未見報道。

5.3轉(zhuǎn)化方法方面

現(xiàn)今農(nóng)桿菌介導(dǎo)的單子葉和谷類植物的轉(zhuǎn)化基本以幼胚為起始材料,取材受到生長周期限制。因此,實踐上迫切需要發(fā)展一些容易并且能夠經(jīng)常大量獲得的外植體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系,不需要組培而直接獲得轉(zhuǎn)基因植株的方法將十分有意義。

6參考文獻

[1] MAYERHOFER R,KONCZKALMAN Z,NAWRATH C,et al. T-DNA integration:A mode of illegitimate recombination in plants[J]. EMBOJ,1991(10):697-704.

[2] 李子銀,胡會慶.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化進展[J].生物工程進展,1998,18(3):22-26.

[3] 張秀君,荊玉祥.根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化禾谷類作物及影響其轉(zhuǎn)化的因素[J].生命科學(xué),2001,13(5):219-221.

[4] 彭友良,彭日荷,黃曉敏,等.帶內(nèi)含子卡那霉素抗性基因雙載體構(gòu)建及煙草轉(zhuǎn)化[J].植物生理學(xué)報,2001,27(1):55-60.