劉中華　王華巖　喬憲鳳　鄭新民

摘要：簡(jiǎn)要介紹了幾種比較常用的轉(zhuǎn)基因方法，包括顯微注射法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法、電轉(zhuǎn)染法、胚胎干細(xì)胞法、病毒載體法、精于載體法、卵巢直接注射法。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因方法與基因打靶、體細(xì)胞核移植、RNA干擾以及線粒體轉(zhuǎn)移技術(shù)相結(jié)合，在基因功能研究和疾病治療中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。特別是近年來(lái)在植物上出現(xiàn)的外源基因清除技術(shù)，為我們?cè)趧?dòng)物上徹底去除外源基因的影響提供了新思路。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因技術(shù)；動(dòng)物；外源基因：遺傳改良

中圖分類(lèi)號(hào)：Q812；S813 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114(2009)02-0481-06

動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將外源基因?qū)肴嘶騽?dòng)物細(xì)胞內(nèi)，使外源性基因整合在染色體基因組上并穩(wěn)定的傳給下一代。1976年。Jaenisch等利用反轉(zhuǎn)錄病毒感染胚胎的方法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移，這是最早的動(dòng)物轉(zhuǎn)基因方法的應(yīng)用。隨后各國(guó)研究者相繼在小鼠、大鼠、兔、綿羊、豬、山羊、雞、蛙、魚(yú)類(lèi)等動(dòng)物上獲得成功，使用的方法也不盡相同，包括顯微注射法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法、電轉(zhuǎn)染法、病毒載體法、精子載體法等。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因方法與前沿的生物學(xué)技術(shù)如基因打靶、體細(xì)胞核移植、RNA干擾等相結(jié)合，越來(lái)越顯示了其強(qiáng)大的生命力。隨著轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品已經(jīng)廣泛滲透到醫(yī)療、衛(wèi)生、農(nóng)產(chǎn)品和食品等中。

1動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)

1．1顯微注射法

顯微注射法(microiniection)是指通過(guò)顯微操作儀將外源基因注入受體動(dòng)物受精卵的細(xì)胞核中，外源基因整合到受體細(xì)胞染色體上，發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的技術(shù)。1980年，Gordon等L2)利用顯微注射的方法將構(gòu)建的HSV-Tx融合基因轉(zhuǎn)入小鼠的基因組，在得到的78只仔鼠中有2只為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。1982，Palmiter等L3)應(yīng)用顯微注射技術(shù)成功地將大鼠的生長(zhǎng)激素基因注射到小鼠受精卵的雄原核中，獲得了整合并表達(dá)外源性生長(zhǎng)激素的超級(jí)轉(zhuǎn)基因“碩鼠”。

顯微注射法是發(fā)展最早、使用最為廣泛也是最，為有效的轉(zhuǎn)基因方法之一。Zhu等利用顯微注射法生產(chǎn)出轉(zhuǎn)sFat-I基因小鼠。Tang等利用此法制備㈩乳腺中可表達(dá)重組抗CD 20抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠、Manoi等將TAIL-PCR技術(shù)用于分析顯微注射導(dǎo)致的整合位點(diǎn)不確定中，進(jìn)一步拓展了該方法的應(yīng)用范圍。目前，利用此方法已成功的生產(chǎn)出了小鼠、兔、綿羊、豬、牛、魚(yú)和雞等各種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。

1．2脂質(zhì)體介導(dǎo)法

脂質(zhì)體(liposome)特別是陽(yáng)離子脂質(zhì)體(cation-ic liposome)目前是實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究的一種常規(guī)方法。該方法具有生產(chǎn)簡(jiǎn)便、毒性低、無(wú)感染危險(xiǎn)等優(yōu)點(diǎn)。有別于其他類(lèi)型的脂質(zhì)體，陽(yáng)離子脂質(zhì)并不將DNA包裹在其脂質(zhì)雙分子層中，只需將二者直接混合即可得到一種穩(wěn)定的復(fù)合物——liooplexes，因此，復(fù)合物的形成不受DNA體積大小的限制。

1．3電轉(zhuǎn)染法

自Muramatsu等將電轉(zhuǎn)染(eleetroporation)應(yīng)用于小鼠睪丸細(xì)胞獲得成功以來(lái)，電轉(zhuǎn)染目前已成為基因轉(zhuǎn)移的高效且常規(guī)的手段之一。董菊子等對(duì)轉(zhuǎn)染前孵育溫度、滲透壓、電轉(zhuǎn)染參數(shù)、細(xì)胞周期等對(duì)電轉(zhuǎn)染效率有影響的因素進(jìn)行了系統(tǒng)研究，摸索出電轉(zhuǎn)染的合適條件。Umemoto等將pCA GGS-lacZ基因電轉(zhuǎn)染小鼠睪丸并設(shè)計(jì)了一系列對(duì)照，結(jié)果電轉(zhuǎn)染對(duì)小鼠后代的數(shù)量并無(wú)顯著影響。Nataeha等川在研究改進(jìn)一種新的WISH方法時(shí)也使用了電轉(zhuǎn)染方法。

1．4胚胎干細(xì)胞法

胚胎干細(xì)胞(ESC)是從早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)建立起來(lái)的多潛能細(xì)胞系，注射于動(dòng)物囊胚后可參與宿主的胚胎形成嵌合體，直至達(dá)到種內(nèi)嵌合，因此可將其作為一種載體，導(dǎo)入外源基因，獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。Capeeehi等首先對(duì)小鼠ES細(xì)胞進(jìn)行了基因打靶，然后將此打靶的ES細(xì)胞移植進(jìn)入小鼠囊胚，將此重組胚移植進(jìn)入代孕母鼠，最后產(chǎn)出嵌合體仔鼠，通過(guò)相互交配獲得基因敲除的純合小鼠。ES細(xì)胞介導(dǎo)技術(shù)是公認(rèn)的研究基因轉(zhuǎn)移、基因定位整合的一類(lèi)極有前途的實(shí)驗(yàn)方法。此法可使受體動(dòng)物細(xì)胞中基因整合率達(dá)到50％，其中生殖細(xì)胞整合率達(dá)30％。目前，胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法在小鼠上應(yīng)用比較成熟，在大動(dòng)物上應(yīng)用較晚。

1．5病毒載體法

目前使用較多的是逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法(retro-virus-mediated gene transfer)。該方法是利用逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)區(qū)域具有轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子活性這一特點(diǎn)，將外源基因連接到LTR下部進(jìn)行重組后，包裝成高滴度病毒顆粒，直接感染受精卵，或微注入囊胚腔中。攜帶外源基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA可以整合到宿主染色體上。1974年，Jaenish等將SV40 DNA注入小鼠囊胚腔中，發(fā)現(xiàn)獲得的小鼠體內(nèi)有SV40 DNA整合。次年，他又成功地用鼠白血病病毒(MuLV)作為載體，將外源基因?qū)胄∈笈咛ァ?990年，Harvcy用貓白血病病毒作為載體，也成功地將外源基因?qū)肴ネ该鲙У难蚺咛ブ小Ｄ壳?，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體已廣泛應(yīng)用于各種動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因研究中。

另一種常用的是腺病毒感染法(adenovirus-mediated gene transfer)?？茖W(xué)研究者已經(jīng)對(duì)這類(lèi)載體進(jìn)行了3次改造，使其在外源DNA裝載容量、安全性、外源基因表達(dá)的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率等方面得到了很大提高。Matthias等利用腺病毒將轉(zhuǎn)化多能干細(xì)胞的4個(gè)必需基因轉(zhuǎn)染到小鼠的正常細(xì)胞內(nèi)，腺病毒直接作用于蛋白質(zhì)而不是染色體，不會(huì)改變宿主DNA，并且經(jīng)過(guò)幾次分裂后就會(huì)被清除，因此不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生危害。通過(guò)這種方法，研究者已經(jīng)從大鼠皮膚細(xì)胞、胚胎肝細(xì)胞以及成熟肝細(xì)胞成功且安全地誘導(dǎo)出了多能干細(xì)胞。

總的來(lái)說(shuō)。病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染效率高，可攜帶大片段的DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)移，但其靶向性和組織特異性差。生物危害比較大，可引起感染及炎癥反應(yīng)，因此其應(yīng)用受到一定程度的限制。

1．6精子載體法

早在1971年，Brackett等研究發(fā)現(xiàn)，兔精于和3H-胸腺嘧啶標(biāo)記的SV40 DNA共溫育，在精子頭部的頂體后區(qū)可檢測(cè)到放射性物質(zhì)存在，當(dāng)這些精于和CV-1腎細(xì)胞融合后可以分離到具有感染性的SV40病毒，這些證據(jù)顯示兔精于具有吸附外源DNA的能力。1989年Lavitrano等首次利用小鼠附睪精于與DNA溫育產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠，稱(chēng)之為精于介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因法(SMGT)。Sato等通過(guò)直接注射外源DNA到小鼠睪丸內(nèi)完成轉(zhuǎn)基因，發(fā)展了一種新的轉(zhuǎn)基因途徑，即睪丸介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因法(TMGT)。Sato等向小鼠睪丸內(nèi)注射臺(tái)盼藍(lán)和Hoechst33342染料，發(fā)現(xiàn)這些染料1min內(nèi)即可通過(guò)附睪頭導(dǎo)管傳遍睪丸網(wǎng)。Shen等直接向雄兔睪

丸內(nèi)注射攜帶綠色熒光表達(dá)的外源DNA及二甲基亞楓的介質(zhì)，使DNA能夠進(jìn)入睪丸細(xì)胞和生精細(xì)胞，1個(gè)月后用處理的雄兔與雌兔交配，所產(chǎn)后代中56％的仔兔能高效地表達(dá)所導(dǎo)入的外源基因，Ko-jima等rD將攜帶報(bào)告基因LacZ的腺病毒載體直接注射到小鼠睪丸內(nèi)，之后利用PCR、RT-PCR、免疫組化對(duì)其生殖系細(xì)胞和后代進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)腺病毒載體只能感染非生殖細(xì)胞，不能傳給下一代，因而研究者可以將腺病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用于體細(xì)胞功能障礙引起的雄性不育研究中。

1．7卵巢內(nèi)直接注射

人們?cè)谘芯坷镁谧鳛檩d體進(jìn)行動(dòng)物轉(zhuǎn)基因同時(shí)，也試驗(yàn)了雌性生殖系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因的可行性、Gordon率先嘗試向小鼠卵巢內(nèi)直接注射包含報(bào)告基因LacZ的腺病毒載體。結(jié)果表明腺病毒載體不能感染卵子，這種載體在雌性生殖系轉(zhuǎn)染效率是很低的。兩年后，Sato等將質(zhì)粒DNA注射到小鼠卵巢中并進(jìn)行體內(nèi)電轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)基因效率變化較大(8％～60％)。Yang等直接對(duì)小鼠的卵巢注射表達(dá)質(zhì)粒plRES-EGFP，得到了轉(zhuǎn)基因小鼠，檢測(cè)后代的陽(yáng)性率達(dá)54％，并且發(fā)現(xiàn)獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠6代以?xún)?nèi)都具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

2動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用

2．1基因打靶與轉(zhuǎn)基因

基因打靶(cerie targeting)是基因同源重組技術(shù)的一種，就是利用同源重組的原理，用外源性DNA定點(diǎn)修飾改造染色體目的基因的方法，包括基因敲除(knock out)和基因敲入(knock in)技術(shù)?；虼虬袑?shí)際上是轉(zhuǎn)基因?qū)W、同源重組和胚胎干細(xì)胞3種技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物。

Brown等成功地在人正常二倍體成纖維細(xì)胞中敲除了p21基因，揭示了p21與細(xì)胞衰老間的關(guān)系。Chan等在HC7116細(xì)胞系中成功敲除了14-3-3σ基因，證明該基因在DNA發(fā)生損傷后參與維持G2期檢驗(yàn)點(diǎn)并阻止細(xì)胞死亡。但質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入細(xì)胞及整合進(jìn)特異位點(diǎn)的效率較低，增加了試驗(yàn)的成本和操作的復(fù)雜性。重組腺相關(guān)病毒(rAAV)載體的出現(xiàn)在一定程度上克服了上述缺點(diǎn)。Topaloglu等分別利用質(zhì)粒載體和腺病毒相關(guān)載體對(duì)人直腸癌細(xì)胞系p53基因進(jìn)行打靶，結(jié)果顯示腺病毒相關(guān)載體打靶效率是質(zhì)粒載體的25倍。人們?cè)诔Ｒ?guī)基因打靶的基礎(chǔ)上引入Cre/loxP系統(tǒng)，建立了一種可以在特定的發(fā)育階段和特定的組織細(xì)胞中開(kāi)啟或關(guān)閉特定基因的時(shí)空特異性基因打靶(spatiotempo-ral gene targeting，STGT)技術(shù)。He等用Syn-Cre小鼠研究大腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)及其受體在癲癇發(fā)病中的作用，Lin等構(gòu)建Ksp-Cre小鼠特異性地敲除腎臟上皮細(xì)胞纖毛蛋白KIF3A和轉(zhuǎn)錄因子HNF-1B，均采用了該技術(shù)。

2．2體細(xì)胞核移植與轉(zhuǎn)基因

利用基因工程技術(shù)將目的基因整合到動(dòng)物體細(xì)胞染色體中，并將其作為供體核移植入受體(去核卵母細(xì)胞)構(gòu)成重建胚，然后將其植入假孕母體，待其妊娠、分娩，便可得到經(jīng)定向遺傳修飾的轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物。這其實(shí)是體細(xì)胞核移植技術(shù)與轉(zhuǎn)基因技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物。體細(xì)胞核移植技術(shù)路線所獲得的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其機(jī)體各組織細(xì)胞均源自于最初形成重構(gòu)胚的體細(xì)胞核，理論上來(lái)說(shuō)由其所形成的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物應(yīng)該全身的各組織細(xì)胞都具有同供核細(xì)胞一樣的基因型，而通過(guò)其他途徑獲得的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物有時(shí)會(huì)出現(xiàn)嵌合基因。

國(guó)外很早就有這方面的報(bào)道，Lai等叫采用核移植技術(shù)生產(chǎn)出世界第一只綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因豬。張運(yùn)海等叫利用體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)出表達(dá)綠色熒光蛋白的豬轉(zhuǎn)基因克隆胚胎：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院劉忠華等以綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染后的陽(yáng)性細(xì)胞作為體細(xì)胞核移植的核供體，以體外成熟卵母細(xì)胞為核受體，構(gòu)建了綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因克隆豬胚胎，并對(duì)重構(gòu)胚在體外和體內(nèi)發(fā)育情況以及綠色熒光蛋白表達(dá)情況進(jìn)行了跟蹤研究，共出生克隆豬6頭，其中4頭為GFP陽(yáng)性，表明我國(guó)科學(xué)家已經(jīng)具備采用體細(xì)胞核移植技術(shù)路線制作轉(zhuǎn)基因豬的全部技術(shù)。

2．3RNA干擾與轉(zhuǎn)基因

RNA干擾(RNA interference)是雙鏈RNA介導(dǎo)的特異性基因沉默現(xiàn)象，是真核生物中普遍存在的古老而保守的自身防御機(jī)制和內(nèi)源性基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，1998年Fire等C38，首次發(fā)現(xiàn)RNA干擾現(xiàn)象，隨后RNA干擾的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究迅速成為21世紀(jì)初生命科學(xué)中的熱點(diǎn)領(lǐng)域。一直以來(lái)，基于同源重組的基因敲除技術(shù)是研究?jī)?nèi)源性基因功能缺失的主要手段，但其缺點(diǎn)是耗時(shí)費(fèi)力，難度較大。近年發(fā)展的RNAi技術(shù)與轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合，通過(guò)抑制內(nèi)源基因的表達(dá)或mRNA的降解，特異地、部分地和可逆地使目的基因表達(dá)下調(diào)沉默，從而實(shí)現(xiàn)基因調(diào)控的時(shí)空性和可逆性。

Paula等利用原核顯微注射法向小鼠卵子內(nèi)導(dǎo)入卵子特異性啟動(dòng)子Z03啟動(dòng)的打靶Mos mR-NA的長(zhǎng)雙鏈RNA，成功的生產(chǎn)出轉(zhuǎn)基因后代。Williams等針對(duì)睪丸特異性基因PLC-l設(shè)計(jì)shRNA，然后克隆進(jìn)入載體，顯微注射人小鼠睪丸，克服了長(zhǎng)期以來(lái)雄性生殖細(xì)胞體外難以培養(yǎng)的缺點(diǎn)。隨后研究者利用Cre/LoxP系統(tǒng)，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出在時(shí)間和空間上可調(diào)控的RNA干擾技術(shù)。Diekins等將啟動(dòng)子四環(huán)素反應(yīng)元件(tetracyclin responseelement.TRE)與RNA干擾基因一起克隆進(jìn)載體并轉(zhuǎn)入小鼠中，然后該小鼠與含有四環(huán)素轉(zhuǎn)錄激活因子的轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，制備同時(shí)含有兩套元件的轉(zhuǎn)基因小鼠，就可以通過(guò)四環(huán)素藥物的投放來(lái)實(shí)現(xiàn)RNA干擾的可逆調(diào)控。因此利用RNAi制作降低或抑制某些基因或性狀的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，將是一種非常奇妙和有前景的領(lǐng)域。

2．4線粒體與轉(zhuǎn)基因

由于大多數(shù)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物受遺傳鑲嵌性和雜合性的影響，其有性生殖后代變異很大，難以形成可穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因品系。線粒體是普遍存在于動(dòng)植物細(xì)胞內(nèi)的一種具有半自主性的細(xì)胞器，線粒體DNA呈雙鏈環(huán)狀，其遺傳主要表現(xiàn)為母性遺傳，雄性配子對(duì)受精卵mtDNA的貢獻(xiàn)不到0.01％。以線粒體作為轉(zhuǎn)基因載體，即先從受體動(dòng)物細(xì)胞分離出線粒體，再用外源基因?qū)@些線粒體進(jìn)行離體遺傳轉(zhuǎn)化，然后把轉(zhuǎn)基因線粒體導(dǎo)入受體動(dòng)物受精卵，那么由此發(fā)育而成的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物就避開(kāi)了外源基因在染色體上難于整合及隨機(jī)插入等問(wèn)題。

目前利用線粒體作為轉(zhuǎn)基因手段的研究還處于摸索階段。Ebert等將異源線粒體注射人小鼠胚胎，經(jīng)過(guò)注射的胚胎移植后發(fā)育正常，但在出生的仔鼠中檢測(cè)不到異源線粒體。Pinkert等將從Mus spretus系小鼠肝細(xì)胞中分離到的活的線粒體顯微注射人原核期的M.Musculus系小鼠胚胎中，在注射的217枚胚胎中，67枚存活，其中23枚經(jīng)4.5d的體外培養(yǎng)后發(fā)育到囊胚。巢式PCR檢測(cè)的結(jié)果表

明，經(jīng)過(guò)顯微注射的M.Musculus系小鼠胚胎在體外培養(yǎng)時(shí)，無(wú)論是0.5d還是4.5d均能檢測(cè)到Musspretus系小鼠的線粒體。Irwin等將201枚經(jīng)異源線粒體顯微注射的小鼠胚胎移植到假孕母鼠的輸卵管，在生出的93只仔鼠中有5只(3雄2雌)能檢測(cè)到異源線粒體。其中3只雄鼠與M.Musculus系雌小鼠交配，在出生的后代小鼠中(41只)無(wú)一例能檢測(cè)到異源線粒體。這是預(yù)料中的。兩只轉(zhuǎn)線粒體雌鼠中，一只能將異源線粒體傳遞給后代小鼠，另一只不能。線粒體也可以在不同物種間進(jìn)行轉(zhuǎn)移，Sokolova等從人肝臟細(xì)胞中分離出線粒體，顯微注射到小鼠合子，再植入假孕母鼠體內(nèi)發(fā)育，F(xiàn)代小鼠許多組織器官中檢測(cè)到了人體線粒體，Yi等將小鼠肝細(xì)胞分離的線粒體注射入小鼠受精卵后體外培養(yǎng)，囊胚形成率為37.65％，與未注射組20.91％相比，差異顯著，證明異源線粒體可促進(jìn)小鼠胚胎發(fā)育。

上述研究表明動(dòng)物個(gè)體之間進(jìn)行線粒體轉(zhuǎn)移是可能的，但轉(zhuǎn)線粒體基因與轉(zhuǎn)核基因存在很多明顯的區(qū)別，這主要是由于核基因與線粒體基因表達(dá)特征決定的。外源mtDNA在宿主細(xì)胞中的存在形式有兩種可能，要么在核遺傳物質(zhì)與線粒體遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移過(guò)程中，進(jìn)入到宿主線粒體。與宿主mtDNA共存同一線粒體中：也有可能是外源線粒體DNA在宿主細(xì)胞中，重新組裝成為新的線粒體。這還有待進(jìn)一步研究。

3外源基因清除技術(shù)

外源基因清除技術(shù)(Gene-Deletor)是美國(guó)康涅狄格大學(xué)華裔教授李義領(lǐng)導(dǎo)的研究小組發(fā)展起來(lái)的，有望成為解決轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境安全性和食品安全性問(wèn)題的有力工具。該技術(shù)綜合利用了兩套位點(diǎn)特異重組酶的元件，即來(lái)源于細(xì)菌噬菌體的Cre/LoxP系統(tǒng)和來(lái)自于酵母的FLP/FRT系統(tǒng)，這兩套系統(tǒng)均通過(guò)重組酶識(shí)別特定的重組位點(diǎn)將插入該位點(diǎn)間的所有外源基因刪除。Cre/LoxP和FLP/FRT系統(tǒng)已經(jīng)分別用于刪除轉(zhuǎn)基因植物的篩選標(biāo)記序列。外源基因清除技術(shù)綜合應(yīng)用了兩套系統(tǒng)，創(chuàng)造了一個(gè)loxP和FRT的融合識(shí)別位點(diǎn)LF(LoxP-FRT)，獲得了一個(gè)高效基因清除系統(tǒng)。特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)重組酶FLP或者Cre在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間和部位表達(dá)，重組酶識(shí)別融合識(shí)別位點(diǎn)LF.兩個(gè)融合識(shí)別位點(diǎn)之間的序列(包括重組酶的基因序列)在特定的時(shí)期、從特定植物器官的細(xì)胞基因組中全部清除。與以前的相關(guān)技術(shù)相比，外源基因清除技術(shù)具有幾個(gè)顯著優(yōu)點(diǎn)：①能夠?qū)⑥D(zhuǎn)基因植物花粉和種子中的外源基因全部清除。②大幅度地提高了轉(zhuǎn)基因植物中外源基因的刪除效率。實(shí)驗(yàn)證明，在3萬(wàn)多株轉(zhuǎn)基因煙草后代植株中，基因清除效率達(dá)到了100％。③外源基因清除技術(shù)更適合于生產(chǎn)上應(yīng)用，尤其是在第二代(生產(chǎn)者和消費(fèi)者都受益的性狀改良)和第三代(以轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)器)基因工程產(chǎn)品生產(chǎn)中更有應(yīng)用價(jià)值。Gu等首先提出了Cre/LoxP系統(tǒng)(包括Cre重組酶和loxP位點(diǎn)兩部分)。人們很早就在小鼠上應(yīng)用Cre/LoxP系統(tǒng)進(jìn)行研究。Carolyn等在小鼠上試驗(yàn)后認(rèn)為FLP/FRT系統(tǒng)是Cre/LoxP系統(tǒng)的一種有效的替代。我們當(dāng)前面臨的任務(wù)是如何對(duì)Gene-Deletor技術(shù)進(jìn)行一些改造。將其應(yīng)用在動(dòng)物上，這必將給動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)帶來(lái)一些革命性改變。

4問(wèn)題及展望

目前動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展迅速，已經(jīng)在鼠、豬、牛、羊、兔等多種動(dòng)物上獲得成功。但還存在一系列問(wèn)題制約著轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)規(guī)模，如轉(zhuǎn)入基因的內(nèi)在作用機(jī)制研究的還不夠深入，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制作效率還比較低，轉(zhuǎn)入的選擇標(biāo)記性基因還沒(méi)辦法有效清除等等，這些都限制著轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)品的研究與開(kāi)發(fā)。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)與新近出現(xiàn)的分子生物學(xué)研究手段相結(jié)合，豐富了轉(zhuǎn)基因研究領(lǐng)域?；虼虬屑夹g(shù)和體細(xì)胞克隆技術(shù)的發(fā)展，為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備提供了一個(gè)良好的平臺(tái)；基因打靶與RNA干擾結(jié)合轉(zhuǎn)基因技術(shù)，為獲得對(duì)于特定基因進(jìn)行表達(dá)的可控、可逆等精細(xì)調(diào)控提供了新的途徑：線粒體做為轉(zhuǎn)基因載體，將避開(kāi)外源基因在染色體上難于整合及隨機(jī)插入等問(wèn)題：外源基因清除技術(shù)如果應(yīng)用到動(dòng)物上，就可以將轉(zhuǎn)入基因在發(fā)揮作用后及時(shí)清除掉?？梢灶A(yù)見(jiàn)，隨著各種新的生物技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)必將變得更加快捷、方便、高效，能更好的用于制備各種新穎的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，在動(dòng)物新品種培育、醫(yī)學(xué)疾病模型研究和生物制藥等領(lǐng)域發(fā)揮更加重要的作用。

(責(zé)任編輯昌炎新)