王真 高希武 孫克寧 金群華

基礎研究

辛伐他汀對鈦顆粒刺激人單核細胞形成破骨細胞的影響

王真 高希武 孫克寧 金群華

目的研究體外辛伐他汀對鈦顆粒刺激單核細胞形成破骨細胞的影響，探討辛伐他汀防治人工關節(jié)無菌性松動的可能性。方法體外分離培養(yǎng)人外周血單個核細胞并分成5組，A組為鈦顆粒刺激組（單核細胞和磨屑混合培養(yǎng)），B組為10-5mol/L辛伐他汀組（單核細胞、磨屑混合培養(yǎng)+10-5mol/L辛伐他?。?，C組為10-6mol/L辛伐他汀組（單核細胞、磨屑混合培養(yǎng)+10-6mol/L辛伐他?。?，D組為10-7mol/L辛伐他汀組（單核細胞、磨屑混合培養(yǎng)+10-7mol/L辛伐他汀），E組為單核細胞組。各組細胞培養(yǎng)24 h后取上清液，用ELISA法檢測上清液中腫瘤壞死因子(TNF-α)、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）的含量。分別培養(yǎng)10 d、18 d后進行TRAP染色陽性細胞計數，采用掃描電鏡檢測骨磨片的吸收陷窩，觀察鈦顆粒對破骨細胞形成的影響。結果磨屑刺激單個核細胞分泌溶骨因子，辛伐他汀抑制磨損顆粒刺激單核/巨噬細胞分泌TNF-α及MCP-1；且破骨細胞數明顯減少，骨吸收陷窩數減少，與鈦顆粒組刺激組比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)。結論辛伐他汀通過抑制TNF-α、MCP-1的釋放而有效防止磨屑誘導的骨溶解，有望成為防治人工關節(jié)無菌性松動的一種有潛力的藥物。

辛伐他汀；破骨細胞；單核細胞；鈦；骨質溶解

目前，全世界每年開展的關節(jié)置換手術超過100萬例，其中大約10%的病人在術后10年內可能發(fā)生假體周圍骨溶解并導致人工關節(jié)無菌性松動[1]。目前尚無公認的有效藥物能夠預防或抑制假體周圍骨溶解，而假體遠期無菌性松動只能通過關節(jié)翻修手術進行治療。他汀類藥物(statins)是臨床廣泛應用的降低膽固醇的藥物。Mundy等[2]研究發(fā)現，他汀類藥物不僅能夠促進成骨，而且可使小鼠破骨細胞減少約25%左右。本文通過體外實驗研究探討辛伐他汀對鈦顆粒誘導人單核細胞形成破骨細胞的影響，進一步分析他汀類藥物防治人工關節(jié)無菌性松動的可能性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

外周血來源 本組10例均為成年健康志愿者（均已簽署知情同意書），21～35歲，中位年齡32歲。共抽血45 ml，肝素抗凝，其中3 ml標本用于血常規(guī)檢查，白細胞計數均在正常范圍內。

1.2 主要試劑及藥品

RPMI-1640培養(yǎng)基（Hyclone公司），胎牛血清（杭州四季青公司），6孔培養(yǎng)板（Corning公司），鈦顆粒（Zimmer公司提供，經掃描電鏡掃描證實90%顆粒＜10 μm，圖1），單核細胞分離液（購自天津灝洋）；辛伐他汀片（Simvastatin Merk sharp& Dohme Ltd.U.K惠贈），U0126（購自promga公司）；ELISA試劑盒(上海船夫生物公司)；奈酚AS-BI磷酸鈉、酒石酸鉀鈉（購自sigma公司）；骨磨片（解放軍301骨研所惠贈）；KYKY2800B掃描電鏡（寧夏回族自治區(qū)能源化工重點試驗室提供）。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 無菌采集外周血以RPMI-1640液稀釋1倍，分層液梯度離心法分離出單個核細胞（3 000轉/min，25 min）。毛細管小心吸取單個核細胞，RPMI-1640液洗滌1 000 r/min，10 min，3次；單核細胞計數用流式細胞染色檢測抗CD14+陽性細胞為準。單核細胞加10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液制成細胞懸液，細胞計數，調整細胞至1×106/ml，臺盼蘭檢測細胞活力均＞95%。事先將滅菌的6 mm直徑的骨磨片和8 mm直徑的蓋玻片2塊分別放入6孔細胞培養(yǎng)板，向培養(yǎng)板中滴加細胞懸液，每孔加3 ml。置37℃、5%CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h，使細胞貼壁，利用單核細胞的貼壁性，洗去非貼壁細胞，留下單核細胞。每板有1孔加入含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液3 ml，余4孔中加入濃度為0.1%（W/V%）的鈦顆粒懸液1 ml，其中3孔內分別加入濃度為10-5、10-6、10-7mol/L的辛伐他汀。實驗分組如下：A組為鈦顆粒刺激組（單核細胞和磨屑混合培養(yǎng)），B組為10-5mol/L辛伐他汀組（單核細胞、磨屑混合培養(yǎng)+10-5mol/L辛伐他?。?，C組為10-6mol/L辛伐他汀組（單核細胞、磨屑混合培養(yǎng)+10-6mol/L辛伐他?。珼組為10-7mol/L辛伐他汀組（單核細胞、磨屑混合培養(yǎng)+10-7mol/L辛伐他汀），E組為單核細胞組?；靹?，同條件培養(yǎng)24 h，留上清液離心后置于－80℃冰箱，用于檢測細胞因子。之后每3天更換一次培養(yǎng)液，分別于培養(yǎng)10 d、18 d后進行TRAP染色陽性細胞計數。采用掃描電鏡觀察骨磨片的吸收陷窩。每組設3個復孔。以上試驗均重復2次。

圖1 鈦顆粒掃描電鏡結果（×1 000）

1.3.2 破骨細胞的鑒定及骨磨片掃描電鏡觀察按文獻[3]描述的抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrateresistant acid phosphatase,TRAP）孵育液配制及染色方法進行；光鏡下計算玻片（1 cm2）TRAP陽性破骨細胞總數，細胞核≥3的TRAP染色陽性細胞為破骨細胞。

骨磨片培養(yǎng)18 d后，棄去培養(yǎng)液，骨片2.5%戊二醛4℃固定10 min，0.5%甲苯胺藍室溫染色3 min，蒸餾水沖洗后在100倍光鏡下觀察并計數，鏡下對骨吸收陷窩（呈圓形、橢圓形和臘腸形等典型形態(tài)，邊界清楚的藍紫色異染區(qū)）觀察計數，取均值。骨磨片清洗后2.5%戊二醛固定2 h，1%鋨酸固定2 h，系列酒精脫水，醋酸異戊酯置換酒精，二氧化碳臨界點干燥鍍金，掃描電鏡觀察。

1.3.3 細胞因子的檢測 上清液解凍后，用ELISA試劑盒檢測腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α,TNF-α）及單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1,MCP-1）的含量。

1.3.4 統計學方法 采用SPSS 11.5統計軟件包進行統計分析，數據以均數±標準差（x-±s）表示。組間整體比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q法，比較辛伐他汀藥物組間破骨細胞數及TNF、MCP細胞因子的差異，以P＜0.05為差異有統計學意義。

圖2 2A 10 d空白對照組 2B 10 d鈦顆粒刺激組 2C 10 d 10-7mol/L辛伐他汀干預組 2D 1 8 d鈦顆粒刺激組 2E 18 d 10-7mol/ L辛伐他汀干預組 2F 18 d 10-5mol/L辛伐他汀干預組（TRAP染色，×40）

表1 辛伐他汀對鈦顆粒刺激單核/巨噬細胞形成破骨細胞的比較（n=10，x-±s）

2 結果

2.1 光鏡及掃描電鏡觀察結果

如圖2所示，TRAP染色陽性的破骨細胞胞體大，形態(tài)不規(guī)則，胞質內可見較多桔紅色顆粒，核淡染，可見偽足伸出；細胞培養(yǎng)10 d時，鈦顆粒刺激組及10-7mol/L辛伐他汀組均有少量破骨細胞形成，細胞核數目較少；細胞培養(yǎng)至18 d，破骨細胞數和細胞核數目明顯增多。各組破骨細胞形成的比較結果（表1）提示，A組的破骨細胞數明顯多于B、C、D組（P＜0.001），C、D組之間差異無統計學（P=0.078），而B組與C、D組之間有顯著性差異（P＜0.001）；辛伐他汀干預組與鈦顆粒刺激組相比骨陷窩數明顯減少（圖3），差異均有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 細胞因子檢測結果

如表2所示，鈦顆粒刺激組TNF-α及MCP-1的含量明顯高于其它組，差異具有顯著性意義（P＜0.001）；與其他辛伐他汀組比較，鈦顆粒刺激+10-5mol/L辛伐他汀組抑制磨屑刺激人單核/巨噬細胞分泌TNF-α及MCP-1的過程呈劑量依賴性，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表2 辛伐他汀對鈦顆粒刺激單核/巨噬細胞TNF-α及MCP-1的影響，用OD值表示（n=10，x-±s）

3 討論

圖3 骨片掃描電鏡結果（×1 000）

手術技術、假體設計工藝的提高以及高耐磨材料的使用，大大降低了人工關節(jié)松動的發(fā)生率，目前限制該技術發(fā)展的主要問題是假體周圍磨損微粒誘導的骨溶解所導致的假體松動。隨著新一代金屬假體的應用，金屬磨損產物在人工關節(jié)無菌性松動中的作用日益受到重視。人工關節(jié)磨損產物刺激人單核巨噬細胞產生大量溶骨性因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6等，其中TNF-α被認為是引起骨吸收的最重要的炎性細胞因子之一[4]。我們以往的研究證實，鈦顆粒刺激培養(yǎng)的巨噬細胞，可以產生大量的TNF-α、IL-1、IL-6[5]。國外學者的研究顯示，在骨質溶解患者的假體周圍組織中，MCP-1等趨化因子呈陽性表達。將巨噬細胞、成纖維細胞、聚甲基丙烯酸甲酯、鈦顆粒進行共培養(yǎng)，可以發(fā)現趨化因子表達增加[6,7]。Kaufman等[8]采用蛋白組學方法檢測巨噬細胞分泌的30種細胞因子和趨化因子含量，發(fā)現金屬顆粒刺激產生的炎性因子最多，而IL-1、TNF-α和MCP-1被認為是骨溶解的始動因子，與人工關節(jié)松動假體周圍骨吸收密切相關。MCP-1促進單核/巨噬細胞合成和分泌TNF-α的特性在體外實驗中也得到證實，反之，TNF-α亦可刺激單核細胞分泌MCP-1[9,10]。體外實驗中，激活的淋巴細胞、內皮細胞、巨噬細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞等多種細胞均可產生MCP-1，IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性細胞因子均可促進MCP-1表達，從而加速破骨細胞形成，參與骨吸收過程。因此，本實驗通過抑制TNF-α、MCP-1表達以減少破骨細胞數目，從而達到抑制骨溶解的目的。

他汀類藥物即3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(3-hydroxy-3-methyglutaryl-coenzyme A,HMGCoA)還原酶抑制劑，是廣泛應用于臨床的降脂藥物，可通過抑制HMG-CoA還原酶進而減少甲羥戊酸的合成，而甲羥戊酸通路又是N-二膦酸鹽抑制破骨細胞骨吸收的主要途徑[11]。由此可見，他汀類藥物對破骨細胞形成的抑制主要是通過抑制甲羥戊酸途徑而在膽固醇合成途徑的早期發(fā)揮作用。體外實驗已經證明他汀類藥物可以影響破骨細胞的骨吸收[12]，近期研究亦表明他汀類藥物可以明顯抑制巨噬細胞產生TNF-α及MCP-1[13,14]；本實驗的研究結果證實，辛伐他汀可通過抑制外周血單核細胞分泌TNF-α及MCP-1而達到減少破骨細胞的形成進而抑制骨溶解的作用，有望成為防治無菌性人工關節(jié)松動的藥物。

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（本文編輯 陳娜）

Effect of simvastatin on inhibiting osteoclasts cytomorphosis from PBMC stimulated by Ti particles

WANGZhen*,GAO Xi-wu,SUN Ke-ning,JIN Qun-hua.*Graduate school ofNingxia Medical University,Yinchuan 750004,China

JIN Qun-hua,E-mail:jinqunhua@sina.com

Objective To investigate the effect of simvastatin on inhibiting osteoclasts cytomorphosis from PBMC stimulated by Ti particles,and the potential prevention effect on the aseptic loosening of prosthesis. Methods In vitro human peripheral blood mononuclear cells(PBMC)were separated,cultured into five groups，as group A:PBMC and Ti particles，group B:PBMC and Ti particles with 10-5mol/L simvastatin，group C: PBMC and Ti particles with 10-6mol/L simvastatin,group D:PBMC and Ti particles with 10-7mol/L simvastatin，group E:PBMC group.The productions of TNF-α and MCP-1 in the suspension of each group were tested by ELISA.After 10 and 18 days incubation,osteoclasts were counted by TRAP-positive staining and their functions were assessed by absorption laeuna using scanning electron microscope(SEM)on the slice.Results The productions of TNF-α,MCP-1 from PBMC stimulated by Ti particles were inhibited when simvastatin was used, the numbers of osteoclasts and absorption laeuna in the treatment groups were lesser than in the Ti induced group (P＜0.05).Conclusion Simvastatin can inhibit bone absorptive factors expression induced by wear particles.As a result,it may be applied to prevent and treat aseptic loosening of prosthesis.

Simvastatin;Osteoclasts;Monocytes;Titanium;Osteolysis

R687.4,R96

A

1674-666X(2009)02-0125-04

10.3969/j.issn.1674-666X.2009.02.012

750004寧夏銀川，寧夏醫(yī)科大學研究生院（王真，高希武，孫克寧）；寧夏醫(yī)科大學附屬醫(yī)院骨三科（高希武，金群華）

金群華，E-mail：jinqunhua@sina.com