許志成 張文杰 李宏 周廣東 崔磊 劉偉 曹誼林

應(yīng)用生物反應(yīng)器構(gòu)建組織工程化血管的實(shí)驗(yàn)研究

許志成 張文杰 李宏 周廣東 崔磊 劉偉 曹誼林

目的探討利用生物反應(yīng)器體外構(gòu)建具有完整結(jié)構(gòu)的組織工程化血管的可行性。方法從6月齡畢格犬頸總動(dòng)脈獲取平滑肌細(xì)胞，頸外靜脈獲取內(nèi)皮細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)擴(kuò)增。然后，先將平滑肌細(xì)胞接種于聚羥基乙酸（PGA）上，形成細(xì)胞—材料復(fù)合物，將該復(fù)合物置于生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)。模擬成年哺乳動(dòng)物循環(huán)系統(tǒng)的參數(shù)，予以動(dòng)態(tài)力學(xué)刺激（搏動(dòng)頻率：75次/分；擴(kuò)張量＜5%）。8周后，在其上接種內(nèi)皮細(xì)胞，對(duì)照組不接種內(nèi)皮細(xì)胞，培養(yǎng)5 d后取材檢測(cè)。結(jié)果組織學(xué)染色顯示，平滑肌纖維成分排列較規(guī)則，有層次感，內(nèi)皮細(xì)胞完整；對(duì)照組未見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞層結(jié)構(gòu)。結(jié)論利用生物反應(yīng)器可在體外構(gòu)建具有完整結(jié)構(gòu)的組織工程化血管。

組織工程生物反應(yīng)器血管構(gòu)建

尋求理想的血管移植物是臨床亟待解決的重大課題，組織工程學(xué)為這一難題的解決帶來(lái)了希望。血管是在持續(xù)的血流動(dòng)力學(xué)刺激下形成并生長(zhǎng)的特殊組織，而體外靜態(tài)環(huán)境下構(gòu)建的血管組織結(jié)構(gòu)欠佳，缺乏正常的生理功能[1-4]。我們的前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在血管構(gòu)建過(guò)程中引入力學(xué)刺激因素是可行的[5]。應(yīng)用能模擬體內(nèi)血液循環(huán)、血管搏動(dòng)的裝置—生物反應(yīng)器，可以產(chǎn)生具有一定力學(xué)強(qiáng)度的組織工程化血管平滑肌層[6-7]。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用生物反應(yīng)器構(gòu)建具有完整內(nèi)皮層與平滑肌層的組織工程化血管。

1 材料與方法

1．1材料

1．1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

畢格犬，6月齡，體重8～10 kg，雌雄不限，上海農(nóng)學(xué)院提供。

1．1．2試劑

胎牛血清（美國(guó)Gibco公司），PBS溶液，一抗:鼠抗人α-SM actin（α-smooth muscle actin）（美國(guó)DAKO公司）；鼠抗人Ⅷ因子抗體（美國(guó)DAKO公司），二抗：EnVisin+TM Peroxidase Mouse（美國(guó)DAKO公司），goat anti-mouse lgG-FITC（fluorescein isothiocyanate）（美國(guó)Santa Cruz公司）。

1．1．3血管生物反應(yīng)器的構(gòu)造

血管生物反應(yīng)器包括反應(yīng)槽、控制器、壓力傳感器、電磁閥、貯液罐及蠕動(dòng)泵，經(jīng)連接組裝后可置于培養(yǎng)箱內(nèi)[8]，使用前予以環(huán)氧乙烷熏蒸消毒。

1.1 ．4實(shí)驗(yàn)分組

分實(shí)驗(yàn)組(n=5)與對(duì)照組(n=5)。實(shí)驗(yàn)組在生物反應(yīng)器動(dòng)態(tài)槽內(nèi)予以動(dòng)態(tài)力學(xué)刺激培養(yǎng)，對(duì)照組培養(yǎng)在生物反應(yīng)器靜態(tài)槽內(nèi)。

1．2方法

1．2．1血管平滑肌細(xì)胞的分離、培養(yǎng)

無(wú)菌切取犬一側(cè)頸總動(dòng)脈，將動(dòng)脈中膜剪成1mm×1mm×1mm的組織塊，均勻鋪于培養(yǎng)皿，貼壁后加入含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)匯合后，0.25%胰蛋白酶消化，傳代后繼續(xù)培養(yǎng)，取第2代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1．2．2血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)

無(wú)菌切取一段犬頸外靜脈,PBS沖洗靜脈管腔2～3遍，至沖洗液清亮后，向靜脈管腔內(nèi)灌入0.1%的Ⅰ型膠原酶2 mL，37℃消化15～20 min，收集消化液，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，收集細(xì)胞，洗滌后計(jì)數(shù)，接種于直徑60 mm的培養(yǎng)皿，加入EGM-2培養(yǎng)液，置于37℃、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，次日換液，以后每2～3 d換液1次。

1．2．3形態(tài)學(xué)觀察

倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、基質(zhì)分泌情況和細(xì)胞形態(tài)變化。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)融合時(shí)，PBS沖洗，2%戊二醛固定24 h，收集細(xì)胞，常規(guī)超薄切片，HITACHI-800型透射電鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。平滑肌細(xì)胞-PGA復(fù)合物體外培養(yǎng)4～5 d，留取標(biāo)本，經(jīng)2%戊二醛固定，常規(guī)超薄切片，PHILIPS XL30-ESEM型掃描電鏡觀察細(xì)胞與材料復(fù)合物生長(zhǎng)情況。

1.2.4 細(xì)胞鑒定

進(jìn)行免疫熒光染色，第2代平滑肌細(xì)胞爬片，檢測(cè)α-SM actin；第3代內(nèi)皮細(xì)胞爬片，檢測(cè)Ⅷ因子，以確定細(xì)胞來(lái)源。

1.2.5 細(xì)胞與PGA復(fù)合及生物反應(yīng)器內(nèi)特定參數(shù)下的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)

收集第2代平滑肌細(xì)胞，總數(shù)為2×107個(gè)，離心，去上清液，加入100μl含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，制成細(xì)胞懸液均勻接種于3 cm×2 cm×1 mm的片狀未編織PGA上，置于37℃、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)，4 h后加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，靜置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)液。1周后，將細(xì)胞材料復(fù)合物卷裹于無(wú)菌硅膠管外部。實(shí)驗(yàn)組：將其接于動(dòng)態(tài)槽內(nèi)接口，予以動(dòng)態(tài)力學(xué)刺激，參數(shù)設(shè)定為：搏動(dòng)頻率75次/分，擴(kuò)張量＜5%，壓力為0～0.02 MPa，流量為0～80 mL/min，流量控制電壓為0～5 V（壓力、流量和流量控制電壓在給定的范圍內(nèi)由零開(kāi)始，每日漸增）；對(duì)照組：將其置于生物反應(yīng)器靜態(tài)槽內(nèi)培養(yǎng)。兩組均4～5 d換一次液。8周后收集內(nèi)皮細(xì)胞，制成含內(nèi)皮細(xì)胞總數(shù)為5×106個(gè)的細(xì)胞懸液50μL，均勻接種于管腔內(nèi)表面，EGM-2培養(yǎng)液繼續(xù)體外培養(yǎng)，5 d后取材檢測(cè)。

1.2.6 檢測(cè)

常規(guī)石蠟切片，HE染色顯示血管平滑肌纖維，免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)血管α-SM actin與Ⅷ因子。

2 結(jié)果

2．1平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定

組織塊貼壁培養(yǎng)后第5～6天，鏡下可見(jiàn)細(xì)胞從組織塊周圍爬出，貼壁后伸展變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，4 d后達(dá)融合狀態(tài)[7]。透射電鏡觀察第二代平滑肌細(xì)胞漿，見(jiàn)有長(zhǎng)條形電子密度集中的細(xì)胞器—密斑，是平滑肌細(xì)胞特征性超微結(jié)構(gòu)。免疫熒光檢測(cè)可見(jiàn)細(xì)胞胞漿呈現(xiàn)FITC綠色熒光表達(dá)，為α-SM actin陽(yáng)性，空白對(duì)照及陰性對(duì)照（軟骨細(xì)胞）為陰性。上述結(jié)果說(shuō)明，體外培養(yǎng)的第2代平滑肌細(xì)胞能表達(dá)其特征性指標(biāo)。

2．2內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定

原代內(nèi)皮細(xì)胞在接種培養(yǎng)皿后，2 h內(nèi)貼壁并伸展，呈集落樣生長(zhǎng)（圖1a），2周可達(dá)融合。傳代后的細(xì)胞呈現(xiàn)典型的鵝卵石樣形態(tài)，7 d達(dá)融合狀態(tài)（圖1b）。為鑒定細(xì)胞來(lái)源，取第3代細(xì)胞進(jìn)行透射電鏡觀察，可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞漿內(nèi)有多個(gè)散在的高電子密度的長(zhǎng)桿狀W-P小體（圖1c），是內(nèi)皮細(xì)胞特有的超微結(jié)構(gòu)；第3代細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)，熒光顯微鏡下可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞胞漿呈現(xiàn)FITC綠色熒光，為Ⅷ因子陽(yáng)性（圖1d），空白對(duì)照及陰性對(duì)照（軟骨細(xì)胞）胞漿未呈現(xiàn)FITC綠色熒光表達(dá)，均為陰性。上述結(jié)果說(shuō)明，體外培養(yǎng)的第3代內(nèi)皮細(xì)胞能表達(dá)其特征性指標(biāo)，可用于組織工程化血管構(gòu)建。

2．3大體觀察

培養(yǎng)8周后，可見(jiàn)新生的組織工程化血管形成。兩組血管均色澤光亮，質(zhì)地均勻，管腔圓潤(rùn)，具有一定的彈性（圖2）。

2．4組織學(xué)觀察

2．4．1 HE染色

實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)PGA纖維基本已降解，平滑肌纖維排列規(guī)則，有層次感，分布較均勻，內(nèi)層細(xì)胞結(jié)構(gòu)連續(xù)完整；對(duì)照組細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與實(shí)驗(yàn)組未見(jiàn)明顯差異，但管壁內(nèi)側(cè)未見(jiàn)明顯連續(xù)而完整的細(xì)胞層結(jié)構(gòu)。

2．4．2免疫組織化學(xué)染色

兩組血管的血管壁均呈現(xiàn)層狀棕黃色顆粒沉積，為α-SM actin陽(yáng)性表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組血管壁內(nèi)側(cè)有連續(xù)棕黃色顆粒沉積，為Ⅷ因子陽(yáng)性表達(dá)；對(duì)照組血管壁內(nèi)側(cè)未見(jiàn)明顯Ⅷ因子陽(yáng)性表達(dá)。說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組在管壁內(nèi)側(cè)接種內(nèi)皮細(xì)胞后可產(chǎn)生結(jié)構(gòu)完整的組織工程化血管（圖3）。

圖1 內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

圖2 組織工程化血管大體觀察

圖3 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組8周時(shí)的組織學(xué)檢測(cè)（200×）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在生物反應(yīng)器內(nèi)動(dòng)態(tài)培養(yǎng)6～8周，可形成具有良好組織學(xué)結(jié)構(gòu)與生物力學(xué)性能的組織工程化血管平滑肌層[6-7]。但是，血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管內(nèi)膜的主要成分，為扁平鱗狀細(xì)胞，隨血流呈單層縱向排列，細(xì)胞長(zhǎng)軸與血流方向平行。內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)維持血流的穩(wěn)定，維護(hù)血管壁的完整，穩(wěn)定物質(zhì)交換平衡，參與凝血與抗凝血活動(dòng)，分泌血管舒縮物質(zhì)，攝取、轉(zhuǎn)換或滅活血循環(huán)與局部產(chǎn)生的活性物質(zhì)，調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)等方面都起了至關(guān)重要的作用。因此，血管內(nèi)皮層的構(gòu)建也是至關(guān)重要的。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在生物反應(yīng)器內(nèi)動(dòng)態(tài)環(huán)境下培養(yǎng)的組織工程化血管平滑肌層在復(fù)合內(nèi)皮細(xì)胞后產(chǎn)生的組織工程化血管，組織學(xué)結(jié)構(gòu)層次清晰，平滑肌層排列規(guī)則整齊，內(nèi)皮細(xì)胞層完整。說(shuō)明適宜的力學(xué)刺激有利于血管組織形成及細(xì)胞適應(yīng)性再塑，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌各種血管活性因子，并可間接增加纖溶酶的活性，從而減少內(nèi)皮細(xì)胞脫落。適宜的力學(xué)刺激可以促進(jìn)平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖與分化，促進(jìn)細(xì)胞定向排布，增加膠原含量，從而增加平滑肌細(xì)胞收縮特性。

本實(shí)驗(yàn)中的生物反應(yīng)器，主要模擬了血管承受的雙軸張力，即細(xì)胞橫斷面上的同向張力和軸向張力。對(duì)于血管承受的流體剪切應(yīng)力，即流動(dòng)的血液順血流方向作用于腔側(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞單位面積上的力，尚無(wú)法模擬，而這種力的作用對(duì)形成完整而牢固的內(nèi)皮細(xì)胞層，以達(dá)到穩(wěn)定血流與抗血栓的作用是至關(guān)重要的。因此，進(jìn)一步研究的重點(diǎn)之一，就是完善生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)，使之能模擬流體剪切應(yīng)力作用，以使其能完全模擬體內(nèi)流體作用環(huán)境。

血管本身的生長(zhǎng)發(fā)育是一個(gè)緩慢而復(fù)雜的過(guò)程，其生物力學(xué)性能也是隨著血管的不斷生長(zhǎng)，在血流的不斷作用下而逐漸提高的。體外生物反應(yīng)器的應(yīng)用只是給予細(xì)胞—材料復(fù)合物以理想的啟動(dòng)環(huán)境，使其在形成組織工程化血管的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中更接近體內(nèi)的環(huán)境。其實(shí)，構(gòu)建組織工程化血管的最終目的還是要將其回植于體內(nèi)，用于修復(fù)血管缺損，而體內(nèi)的大環(huán)境才是血管生長(zhǎng)成熟的最佳環(huán)境，體內(nèi)真正的血流刺激才是最有效的作用因素。生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)8周形成的血管組織已基本成熟，結(jié)構(gòu)完整，并且具有一定的生物力學(xué)性能，下一步實(shí)驗(yàn)中可將其回植體內(nèi)，使其在血流的作用下，進(jìn)一步生長(zhǎng)發(fā)育，在適當(dāng)?shù)捏w內(nèi)環(huán)境下達(dá)到完善和提高。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在構(gòu)建組織工程血管中，應(yīng)力對(duì)血管平滑肌的生長(zhǎng)增殖具有一定的促進(jìn)作用，可以刺激平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖與分化，促進(jìn)細(xì)胞定向排布，增加膠原含量，從而增加平滑肌細(xì)胞收縮特性，有利于組織形成及細(xì)胞適應(yīng)性再塑，也更有利于內(nèi)皮細(xì)胞的復(fù)合。本實(shí)驗(yàn)還證實(shí)，在生物反應(yīng)器輔助下，體外可構(gòu)建具有完整組織學(xué)結(jié)構(gòu)的組織工程化血管，為下一步的體內(nèi)回植實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

[1]Weinberg CB,Bell E．A blood vessel model constructed from

collagen and cultured vascular cells[J]．Sci,1986,23:397-340．[2]Shinoka T,Tim DS,Ma PX,et al．Creation of viable pulmonary artery autografts through tissue engineering[J]．J Thorac Cardiovasc Surg,1998,115:536-545．

[3]Bader A,Steinhoff G,Strobl K,etal．Engineerig ofhuman vascular aortic tissue based on a xenogeneic starter matrix[J]．Transplantation, 2000,70:7-14．

[4]L′heureux N,Paquet S,Labbe R,et al．A completely biological tissue-engineeringed human blood vessel[J]．FASEB J,1998,12: 47-55．

[5]Niklason LE,Gao J,Abbott WM,et al．Functional arteries grown in vitro[J]．Sci,1999,284:489-496．

[6]許志成,李宏,周廣東,等．反應(yīng)器內(nèi)構(gòu)建組織工程血管平滑肌層的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華整形外科雜志,2008,24:220-224.

[7]Xu ZC,Zhang WJ,Li H,et al．Engineering of an elastic large muscular vessel wall with pulsatile stimulation in bioreactor[J]．Biomaterials,2008,29:1464-1472．

[8]李宏,許志成,崔磊,等．血管生物反應(yīng)器的研究與應(yīng)用[J].上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2004,24:319-321.

Experimental Study on Tissue Engineered Blood Vessel with Bioreactor

XU Zhicheng1,ZHANG Wenjie1,LI Hong2, ZHOU Guangdong1,CUI Lei2,LIU Wei1,CAO Yilin1.
1 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,The Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University Schoolof Medicine,Shanghai 200011,China.2 Shanghai Tissue Engineering Research and Development Center，Shanghai 200235,China.Corresponding author:CAO Yilin.

ObjectiveTo investigate the feasibility of constructing tissue engineered blood vessels with bioreactor.MethodsCell-PGA(polyglycolic acid)complex was constructed by seeding smooth muscle cells(SMCs)isolated from canine carotid artery on PGA unwoven fibers.The cell-PGA complex was cultured in a bioreactor(pulse rate:75/min，radical distension＜5%).Eight weeks after culture in vitro,Endothelial cells(ECs)isolated from canine carotid vein were seeded on PGA and cultured for another 5 days.The control group was not seeded ECs.Tissue engineered blood vessels were harvested and examined.ResultsHistological staining revealed layered smooth muscle fibers and integral ECs in the tissue engineered blood vessel wall，which was further confirmed by immuno-histological staining.There were no obvious ECs were observed in the control group.ConclusionThe technology of bioreactor could be used to build tissue engineered blood vessel with mimic native blood vessel.

Tissue engineering;Bioreactor;Blood vessel;Reconstruction

Q813.1+2

A

1673－0364（2009）03－0134－04

2009年2月13日；

2009年4月1日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.06.005

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃項(xiàng)目（2005CB522700）。

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整形外科（許志成，張文杰，周廣東，劉偉，曹誼林）；200235上海市上海組織工程研究與開(kāi)發(fā)中心（李宏，崔磊）。

曹誼林。