劉誠(chéng) 付勁松 劉善 周增丁 宋志勇

體外構(gòu)建攜帶PDGF-BB和IGF-1緩釋微粒的脫細(xì)胞人工真皮

劉誠(chéng) 付勁松 劉善 周增丁 宋志勇

目的探討體外構(gòu)建攜帶并持續(xù)釋放血小板源生長(zhǎng)因子(PDGF-BB)和胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)的脫細(xì)胞人工真皮的可行性。方法體外合成含PDGF-BB和IGF-1生長(zhǎng)因子的可降解微球，并與脫細(xì)胞人工真皮聯(lián)結(jié)，Elisa方法檢測(cè)人工真皮中生長(zhǎng)因子釋放情況；通過(guò)攜帶生長(zhǎng)因子的人工真皮與真皮成纖維細(xì)胞的共培養(yǎng)，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)及WST-8比色法，觀察成纖維細(xì)胞的增殖速率與細(xì)胞活力。結(jié)果攜帶生長(zhǎng)因子的人工真皮與真皮成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)組與對(duì)照組細(xì)胞倍增時(shí)間分別為（2.01±0.38）d和（7.27±1.16）d，共培養(yǎng)組細(xì)胞倍增時(shí)間明顯縮短（P＜0.05，n＝5）；體外培養(yǎng)7 d、14 d、21 d時(shí)，共培養(yǎng)組及對(duì)照組細(xì)胞活力無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05，n＝5）。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)成功制備了能持續(xù)釋放PDGFBB和IGF-1生長(zhǎng)因子并加速體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞增殖的人工真皮，為加速創(chuàng)面修復(fù)的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

脫細(xì)胞人工真皮血小板源生長(zhǎng)因子胰島素樣生長(zhǎng)因子微球

在燒傷及其他創(chuàng)傷外科領(lǐng)域中，皮膚大面積缺失較常見(jiàn)。盡管自體皮膚移植的療效明確，但存在來(lái)源受限的問(wèn)題。脫細(xì)胞人工真皮是以人體皮膚作為來(lái)源，具有良好的組織相容性。然而，脫細(xì)胞人工真皮只能作為支架材料，利用其引導(dǎo)細(xì)胞遷移、填充缺損組織[1]。如何改進(jìn)脫細(xì)胞人工真皮以提高皮膚創(chuàng)面修復(fù)的效果，使其盡可能地接近自體皮膚，是近幾年研究的熱點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠來(lái)源PDGF-BB，IGF單克隆抗體（Sigma公司）；ELISA試劑盒（上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司）；CCK-8試劑盒（普洛麥格生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 生長(zhǎng)因子包裝微球制備及裝配

以PDGF-BB微球的制備為例，取120 mg PLGA與5 mg PDGF-BB混懸于經(jīng)0.2μm濾膜過(guò)濾的水1.5 mL中，加混合溶劑（15 mL丙酮、0.5 mL二氯甲烷），加入到抽氣減壓、中等速度攪拌的50 mL聚乙烯醇（PVA）水溶液（20 g/L）中，形成O/W型乳狀液，經(jīng)3～4 h后，納米球在水中進(jìn)一步固化。用濾膜過(guò)濾后，濾液超速離心1 h（40 000 r/min），除去游離的藥物并洗去PVA，所得納米球再分散在水中，再超速離心，即得200～300 nm粒徑的納米球。常規(guī)凍干保存。

1.2.2 PDGF-BB和IGF-1的檢測(cè)

采用雙抗體夾心ELISA法。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔8孔，每孔中各加入樣品稀釋液100μL；第1孔加標(biāo)準(zhǔn)品100μL，混勻后用加樣器吸出100μL，移至第2孔。如此反復(fù)作對(duì)倍稀釋至第7孔。最后，從第7孔中吸出100μL棄去，使體積均為100μL。第8孔為空白對(duì)照。待測(cè)樣品孔每孔各加入待測(cè)樣品100μL。將反應(yīng)板充分混勻后置37℃中120 min。用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，在濾紙上印干。每孔加入第1抗體工作液50μL，將反應(yīng)板置37℃中60 min；每孔加酶標(biāo)抗體工作液100μL，將反應(yīng)板置37℃中60 min；每孔中加入底物工作液100μL，置37℃暗處反應(yīng)5～10 min；每孔加入1滴終止液混勻，在492 nm處測(cè)吸光值。酶標(biāo)儀自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線和測(cè)定樣本濃度值。

1.2.3 細(xì)胞倍增時(shí)間及細(xì)胞活力檢測(cè)

將成纖維細(xì)胞接種于24孔板中（6 000個(gè)/孔），分別進(jìn)行單純培養(yǎng)以及與人工真皮共培養(yǎng)，并在顯微鏡下觀察，于細(xì)胞接種后的第3天、第5天、第7天進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，分別計(jì)算單純培養(yǎng)及共培養(yǎng)情況下細(xì)胞倍增時(shí)間；另選取共培養(yǎng)及對(duì)照組培養(yǎng)至第7天、第14天、第21天的3個(gè)孔的細(xì)胞，向其中加入10μL WST-8溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h，將孔內(nèi)溶液移入96孔板，酶標(biāo)儀測(cè)A450吸光度，每組重復(fù)3次，記錄數(shù)據(jù)，評(píng)價(jià)細(xì)胞活力。

2 結(jié)果

2.1 生長(zhǎng)因子微球PDGF-BB及IGF-1釋放曲線

IGF-1與PDGF在15 d內(nèi)持續(xù)釋放IGF-1、PDGF，兩者濃度平均值范圍分別在20～70 pg/mL及30～80 pg/mL之間，分別達(dá)到IGF-1與PDGF-BB發(fā)揮生物活性作用的濃度（圖1）。

2.2 人工真皮對(duì)成纖維細(xì)胞倍增時(shí)間的影響

攜帶生長(zhǎng)因子的人工真皮與真皮成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)組及對(duì)照組細(xì)胞倍增時(shí)間分別為（2.01±0.38）d，（7.27±1.16）d；共培養(yǎng)組細(xì)胞倍增時(shí)間明顯縮短（P＜0.05，n＝5）（圖2）。

2.3 人工真皮對(duì)成纖維細(xì)胞活力的影響

人工真皮共培養(yǎng)組及對(duì)照組在體外培養(yǎng)7 d、14 d、21 d時(shí)細(xì)胞活力均大于95%，無(wú)顯著性差異（P＞0.05）（圖3）。

圖1 生長(zhǎng)因子微球PDGF-BB及IGF-1釋放曲線

圖2 人工真皮對(duì)成纖維細(xì)胞倍增時(shí)間的影響

圖3 人工真皮對(duì)成纖維細(xì)胞活力的影響

3 討論

在人們探索促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合的過(guò)程中，各種皮膚替代物層出不窮。但是，目前無(wú)論哪種皮膚替代物都不能完全代替自體皮膚移植，只能作為一種輔助方法。盡管脫細(xì)胞人工真皮可以促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合，但是與自體皮膚相比，尚存在不足。脫細(xì)胞真皮缺少細(xì)胞成分，不含生長(zhǎng)因子。因此，無(wú)法達(dá)到真皮移植后，細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)成分協(xié)同促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用[2]。研究認(rèn)為，在皮膚的修復(fù)過(guò)程中，生長(zhǎng)因子通過(guò)細(xì)胞表面的特異性受體發(fā)揮作用，對(duì)細(xì)胞分化、遷移、基質(zhì)合成起著調(diào)節(jié)作用[3-8]。促進(jìn)皮膚愈合的生長(zhǎng)因子中，PDGF-BB（人類(lèi)血小板源性生長(zhǎng)因子）是最受重視的一種[9]，可促進(jìn)間充質(zhì)起源細(xì)胞內(nèi)的DNA合成及細(xì)胞增殖[10-12]，并已經(jīng)獲得FDA批準(zhǔn)使用。IGF-1（胰島素樣生長(zhǎng)因子）是正常表皮角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育所必需的，具有促進(jìn)表皮細(xì)胞以及真皮成纖維細(xì)胞增殖的作用，缺乏IGF-1所形成的表皮比正常表皮薄[13-15]。Lynch等[16]觀察到局部單獨(dú)應(yīng)用PDGF-BB或重組的IGF-1對(duì)促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)作用都不明顯，但將二者合用，在標(biāo)準(zhǔn)缺損創(chuàng)面局部一次性應(yīng)用PDGF-BB計(jì)量達(dá)到500 ng且IGF-1達(dá)到250 ng時(shí)，創(chuàng)面結(jié)締組織以及上皮的生長(zhǎng)明顯加快。

聚乳酸－羥基乙酸共聚物(PLGA)是一種醫(yī)用合成高分子材料，具有很好的生物相容性。可在大范圍內(nèi)形成性能不同的PLA類(lèi)共聚物藥物微球，可提高藥物的穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)藥物控釋或緩釋?zhuān)哂泻芎玫牟僮餍?，且無(wú)毒副作用[17-20]。

脫細(xì)胞人工真皮移植后，加速受區(qū)表皮快速增殖勢(shì)必會(huì)大大提高治療效果。本實(shí)驗(yàn)所采用的PDGF-BB與IGF-1具有極強(qiáng)的促表皮再生能力[21-22]。我們以脫細(xì)胞人工真皮為基礎(chǔ)，并與預(yù)先包裝PDGF-BB以及重組的IGF-1納米微粒結(jié)合。結(jié)果表明，脫細(xì)胞真皮能夠連續(xù)、均勻地釋放IGF-1和PDGF-BB，且在2周內(nèi)始終保持其生物活性作用的濃度。

本研究中制備新型脫細(xì)胞人工真皮，發(fā)揮多種促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合因子的作用，以達(dá)到加速皮膚創(chuàng)傷愈合的目的，為產(chǎn)業(yè)化奠定了良好基礎(chǔ)。

[1]Wang GQ,Xia ZF.Transplantation of epidermis of scar tissue on acellular dermal matrix[J].Burns,2009,35(3):352-355.

[2]Candage R,Jones K,Luchette FA,et al.Use of human acellular dermal matrix for hernia repair:friend or foe[J]?Surgery,2008,44 (4):703-709.

[3]Mauviel A.Transforming growth factor-beta signaling in skin: stromal to epithelial cross-talk[J].J Invest Dermatol,2009,129 (1):7-9.

[4]Hong JP,Kim YW,Lee SK,etal.The effect ofcontinuous release ofrecombinanthuman epidermal growth factor(rh-EGF)in chitosan film on full thickness excisionalporcine wounds[J].Ann Plast Surg, 2008,61(4):457-462.

[5]Akita S,Akino K,Imaizumi T,et al.Basic fibroblast growth factor accelerates and improves second-degree burn wound healing[J]. Wound Repair Regen,2008,16(5):635-641.

[6]Wang HJ,Wan HL,Yang TS,et al.Acceleration of skin graft healing by growth factors[J].Burns,1996,22(1):10-14.

[7]Roberts AB,Anzano MA,Wakefield LM,etal.Type beta transforming growth factor:a bifunctional regulator of cellular growth[J].Proc Natl Acad Sci USA,1985,82(1):119-123.

[8]Micera A,Vigneti E,Pickholtz D,et al.Nerve growth factor displays stimulatory effects on human skin and lung fibroblasts,demonstrating a direct role for this factor in tissue repair[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(11):6162-6167.

[9]Johanna A,Radiosa G,Christer B.Role of platelet-derived growth factors in physiology and medicine[J].Genes Dev,2008,22(10): 1276-1312.

[10]Sun W,Lin H,Xie H,et al.Collagen membranes loaded with collagen-binding human PDGF-BB accelerate wound healing in a rabbit dermal ischemic ulcer model[J].Growth Factors,2007,25 (5):309-318.

[11]Li H,Fu X,Zhang L,et al.Research of PDGF-BB gel on the wound healing of diabetic rats and its pharmacodynamics[J].J Surg Res,2008,145(1):41-48.

[12]Inui H,Kitami Y,Tani M,etal.Differences in signal transduction between platelet-derived growth factor(PDGF)alpha and beta receptors in vascular smooth muscle cells.PDGF-BB is a potent mitogen,but PDGF-AA promotes only protein synthesis without activation of DNA synthesis[J].J Biol Chem,1994,269(48): 30546-30552.

[13]Edmondson SR,Thumiger SP,Kaur P,et al.Insulin-like growth factor binding protein-3(IGFBP-3)localizes to and modulates proliferative epidermal keratinocytes in vivo[J].Br J Dermatol, 2005,152(2):225-230.

[14]Jeschke MG,Barrow RE,Herndon DN.Insulinlike growth factor I plus insulinlike growth factor binding protein 3 attenuates the proinflammatory acute phase response in severely burned children [J].Ann Surg,2000,231(2):246-252.

[15]Tavakkol A,Elder JT,Griffiths CE,et al.Expression of growth hormone receptor,insulin-like growth factor 1(IGF-1)and IGF-1 receptor mRNA and proteins in human skin[J].J Invest Dermatol, 1992,99:343-349.

[16]Lynch SE,Colvin RB,Antoniades HN.Growth factors in wound healing.Single and synergistic effects on partialthickness porcine skin wounds[J].J Clin Invest,1989,84(2):640-646.

[17]Hinds KD,Campbell KM,Holland KM,et al.PEGylated insulin in PLGA microparticles.In vivo and in vitro analysis[J].J Control Release,2005,104(3):447-460.

[18]Cleland JL,Mac A,Boyd B,et al.The stability of recombinant human growth hormone in poly(lactic-co-glycolic acid)(PLGA) microspheres[J].Pharm Res,1997,14(4):420-425.

[19]陳善,李萍,丁建新.牛血清白蛋白乳酸-羥乙酸共聚物微球的制備[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào),2005,21(02):96-100.

[20]段宏.緩釋bFGF2PLGA微球制備及其體外釋藥性質(zhì)和生物活性的研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2004,39(3):196-198.

[21]Goldman R.Growth factors and chronic wound healing:past,present, and future[J].Adv Skin Wound Care,2004,17(1):24-35.

[22]Rollman O,Jensen UB,Ostman A,et al.Platelet derived growth factor(PDGF)responsive epidermis formed from human keratinocytes transduced with the PDGF beta receptor gene[J].J Invest Dermatol, 2003,120(5):742-749.

An Experimental Study on Reconstruction of Acellular Dermal Matrix Carried PDGF-BB and IGF-1

LIU Cheng, FU Jinsong,LIU Shan,ZHOU Zengding,SONG Zhiyong.
Jiangxi Provincial People′s Hospital,Nanchang 330006,China.

ObjectiveTo explore the reconstruction of acellular dermal matrix carried PDGF-BB and IGF-1 in vitro. Also investigate cultured human fibroblast proliferation and collagen production affected by constructed acelluar dermal matrix.MethodsThe degraded micro beads with PDGF-BB and IGF-1 were synthe-sized and connected to acellular dermal matrix.Acelluar dermal matrix was cultured with fibroblast.Fibroblast proliferation rate and cell variability were observed by cell count and WST-8 colorimeter;The release of PDGF-BB and IGF-1 growth factors were measured by ELISA．ResultsThe population doubling time of acellular dermal matrix fibroblast co-culture group and control group was 2.01±0.38 days and 7.27±1.16 days in experimental group and control group respectively.There was significant difference (P＜0.05).But there was no statistically significant difference in cell viability after culture 7,14,21 days.ConclusionAcelluar dermal matrix carried PDGF-BB and IGF-1 micro beads can promote the proliferation of fibroblast with continually release of PDGF-BB and IGF-1 growth factors so it is an effective mothod for wound repair.

Acellular artificial dermal matrix;PDGF-BB;IGF-1;Micro bead

Q813.1+2

A

1673－0364（2009）03－0128－03

2009年1月18日；

2009年3月22日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.06.003

江西省衛(wèi)生局課題（20083011）。

330006江西省南昌市江西省人民醫(yī)院。