陳儒鋼 鞏振輝 逯明輝 李大偉 黃煒

（西北農(nóng)林科技大學園藝學院，陜西楊凌，712100）

抑制性差減雜交結合基因芯片技術在植物基因差異表達研究中的應用

陳儒鋼 鞏振輝 逯明輝 李大偉 黃煒

（西北農(nóng)林科技大學園藝學院，陜西楊凌，712100）

抑制性差減雜交技術和基因芯片技術是近年來發(fā)展起來的研究基因差異表達的2種非常有效的方法。SSH技術或基因芯片技術單獨使用都存在不同程度的缺陷和不足，但若將2種技術結合起來使用，則能充分發(fā)揮各自的優(yōu)勢，并最大限度地彌補各自的不足。鑒于此，對SSH技術與基因芯片技術的原理與優(yōu)缺點以及兩者的結合在植物研究上的應用進行了綜述。

抑制性差減雜交（SSH） 基因芯片 差異表達基因 應用

多細胞生物的正常生長、發(fā)育、代謝、繁殖和衰老以及逆境條件下組織細胞結構與功能的變化，歸根結底是基因在一定時間上或空間上的選擇性表達，即基因差異表達的結果?；虮磉_的變化是調控細胞生命活動過程的核心機制。了解不同條件下基因表達的種類差異，建立相關功能的基因表達譜，對于探究造成生物細胞表型差異的遺傳原因、提供研究復雜生命過程的基本信息以及從整體水平研究代謝機制、了解基因的相互關系至關重要。抑制消減雜交（suppression subtractive hybridization，SSH）技術與基因芯片技術是新近發(fā)展起來的篩選差異表達基因的有用工具，對克隆不同組織細胞間或同一組織不同生理或病理狀態(tài)下的差異表達基因，研究組織細胞的功能、抗病機制、植物各個器官發(fā)育等具有十分重要的意義。但2種方法單獨使用均存在許多不足之處。為了取長補短，近年來很多研究者將這2種方法結合起來，作為一種新的策略共同用于差異表達基因的分離克隆，并取得了很好的效果。本文對抑制消減雜交與基因芯片技術的原理與優(yōu)缺點以及兩者的結合在植物研究上的應用進行綜述。

1 抑制性差減雜交技術

抑制消減雜交技術是1996年由Diatchenko建立的以抑制性PCR為基礎的cDNA消減雜交方法[1]。其依據(jù)的技術主要有兩點：①消減雜交；②抑制PCR。經(jīng)抑制消減雜交后的cDNA群體不僅富集了差異表達基因（目的基因），而且目的基因間豐度的差異經(jīng)過均等化作用已基本消除，使消減后的cDNA群體為豐度一致的目的基因群體。其基本過程是：粗提2種不同細胞（tester和driver）的mRNA，反轉錄成cDNA，用4堿基識別酶 （RsaI）酶切2種cDNA產(chǎn)生平端片段；tester cDNA分別接上adapter1和adapter2，并與過量的經(jīng)RsaI消化的driver樣本雜交。根據(jù)復性動力學原理，豐度高的單鏈cDNA退火時產(chǎn)生的同源雜交速度快于豐度低的單鏈cDNA，從而使得豐度有差別的cDNA的單鏈分子的相對含量趨向一致。這時混合兩份雜交樣品，同時加入新的變性driver cDNA進行第二次消減雜交。雜交完全后補平末端，加入合適引物 （即adapter1和adapter2的部分特異序列）進行PCR擴增，只有含不同接頭的雙鏈DNA分子才可進行指數(shù)擴增，擴增產(chǎn)物即為目的片斷。利用adapter上的酶切位點可進行克隆、測序等。

SSH技術巧妙地利用了抑制PCR擴增技術，克服了其他消減雜交技術的缺陷，具有許多明顯的優(yōu)越性：①假陽性率大大降低，這是它最大的優(yōu)點。這是由它的兩步消減雜交和兩次抑制PCR所保證的。②高敏感性。SSH方法所做的均等化和目標片段的富集，保證了低豐度mRNA也可能被檢出。③速度快，效率高。一次SSH反應可以同時分離幾十或成百個差異表達基因。另外，此技術還具有背景低，重復性好的特點[2]。

同時，SSH也有一定的缺點：①SSH技術需要幾微克量的mRNA，如果量不夠，則低豐度的差異表達基因的cDNA很可能會檢測不到，這是SSH技術不能被廣泛應用的主要障礙。②SSH技術篩查獲得克隆需Northern blot來鑒定驗證，操作繁瑣，效率較低。③SSH技術得到的cDNA是限制酶消化的cDNA，不再是全長cDNA，當然，這個缺陷可以通過篩選cDNA文庫或者采用RACE的方法獲得全長目的基因。④不能同時對數(shù)個材料之間進行比較，材料之間存在過多的差異及小片段缺失也不能被有效檢測。

2 基因芯片技術（Gene Chips）

基因芯片，又稱DNA芯片、DNA微陣列（DNA microarray），是指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律地排列固定于支持物上，然后與待測的標記樣品的基因按堿基配對原理進行雜交，再通過激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進行掃描，并配以計算機系統(tǒng)對每一探針上的熒光信號作出比較和檢測，并用計算機系統(tǒng)分析，從而迅速得出所要的信息[3]?；蛐酒哂懈咄?、高信息量、快速、并行檢測、樣品用量少、用途廣泛等優(yōu)點，已經(jīng)被廣泛應用到基因表達檢測、突變檢測、基因組多態(tài)性分析、基因文庫作圖以及雜交測序等方面。在研究基因差異表達時，通常使用的是cDNA芯片。

基因芯片與傳統(tǒng)的膜雜交相比有以下優(yōu)點：①芯片點樣密度遠遠高于膜的點樣密度，樣品用量少，信息量大。②芯片可用雙色熒光標記兩種探針，這樣大大提高了數(shù)據(jù)準確性；而膜通常用核素標記探針，一張膜只能雜交一種探針，數(shù)據(jù)可比性差；③芯片雜交體積小，靈敏度高；膜雜交體積大，靈敏度差；④芯片具有表面平整性好、硬度大、透明等特點，比易卷曲的膜雜交更容易在點樣、雜交、圖像處理及數(shù)據(jù)采集等方面自動化?；蛐酒哂懈咄?、高信息量、快速、樣品用量少、造價低、用途廣泛等優(yōu)點。但費用太高也限制了基因芯片的廣泛應用，如果處理的樣品太多，很難普及使用。同時基因芯片技術不能分離和鑒定未知基因，這也是限制其廣泛應用的一個重要原因。

3 SSH結合cDNA芯片技術研究基因差異表達的特點

聯(lián)合應用SSH和cDNA芯片技術研究差異表達基因，不僅具有2種技術各自的優(yōu)點，彌補了傳統(tǒng)方法的不足，而且在方法學上開創(chuàng)了克隆基因的新途徑。

SSH技術通過兩次消減使得豐度高低不一的mRNA得以均衡化；通過抑制PCR使得差異表達的基因得以指數(shù)擴增，而共有mRNA擴增得到抑制，從而能夠篩查出低豐度的差異表達基因；同時SSH技術還能夠分離和鑒定未知基因，而這些正是基因芯片技術無法完成的。因此，通過SSH均衡不同豐度的差異表達基因，可大大提高cDNA芯片發(fā)現(xiàn)低豐度差異表達基因和新基因的概率。但通過SSH技術篩查獲得的幾百甚至上千個差異表達克隆基因若都通過Northern blot來鑒定驗證將是一項十分繁重且效率低的工作。而cDNA芯片具有高通量篩選的突出優(yōu)點，將大量的靶基因高度集成在很小的載體上，因此可同時分析成千上萬個基因的表達模式，而且從cDNA芯片的制備到信號的掃描分析多由儀器操作，自動化程度高，檢測速度快，節(jié)省了大量的人力、物力和時間。因此將SSH與cDNA芯片技術相結合，可促進差異表達基因的大規(guī)模快速篩選，從而克服了傳統(tǒng)用Northern blot對SSH構建的文庫克隆進行篩選的低效性，并提高了cDNA芯片發(fā)現(xiàn)低豐度差異表達基因和新基因的概率[4～5]。

同樣任何一種方法都會有其自身的局限性，SSH與cDNA芯片技術的結合也不例外，其具體表現(xiàn)為SSH技術由于需要較多的起始材料且更多地依賴于PCR技術，若mRNA量不夠，則低豐度的差異表達基因cDNA可能檢測不到，而且不能同時對數(shù)個材料之間進行比較，材料之間存在過多的差異及小片段缺失也不能有效被檢測。因此，一次SSH技術分析不可能將所有的差異表達基因一網(wǎng)打盡，SSH結果具有相當?shù)幕蛉恍?。cDNA芯片雖然可以進行高通量篩選，但是卻受到芯片容量的限制。此外，每次雜交需要大量的RNA，對于低拷貝數(shù)的mRNA需要量尤其大[4～5]。

4 SSH結合cDNA芯片技術在植物基因差異表達研究中的應用

Yang G P等在1999年首次將基因芯片技術用于分析SSH所得到的差異克隆的表達情況，通過Northern雜交這種傳統(tǒng)的分子生物學技術證明，基因芯片與SSH技術相結合的方法可以高效地鑒定大量差異表達的基因[6]。自此以后，這種方法得到廣泛的運用。在植物方面，這種方法主要應用于植物的抗逆性及植物發(fā)育的研究。

4.1 植物抗逆性的研究

植物在不同的逆境條件下都會表現(xiàn)出一定的抗性，分析不同逆境脅迫下的差異表達及分離克隆差異表達基因并進行功能分析，有助于闡明逆境調控通路，對進一步揭示逆境脅迫的分子調控途徑具有重要的作用。Zheng J等將SSH與cDNA芯片技術相結合，研究干旱脅迫對玉米幼苗葉和根誘導表達基因的克隆與功能分析，鑒定了一大批玉米抗水分脅迫的基因，并發(fā)現(xiàn)了一些可能與水分脅迫下的信號轉導相關的基因[7]。Tang W等研究了耐漬性不同的玉米在淹水脅迫下的基因表達差異，并發(fā)現(xiàn)了一個可能與缺氧脅迫有關的新基因[8]。Ouyang B等利用抑制差減雜交和芯片技術分析了番茄逆境響應的基因表達譜，結果表明，番茄在鹽脅迫響應中，201個差異表達基因編碼蛋白的可能功能可分為14大類。根據(jù)差異基因的數(shù)量，前5類為代謝、轉錄因子、功能未知、能量代謝和信號轉導類[9]。Verica J A等將SSH結合cDNA芯片技術用于研究可可樹的病害防御反應中由信號分子引起的信號轉導途徑的改變，獲得了一大批上調或下調表達的基因[10]。Botha A M等（2006）用抗蟲性不同的小麥近等基因系構建SSH文庫，結合基因芯片技術發(fā)現(xiàn)了29個與抗蟲性有關的基因，并認為小麥在受到蚜蟲侵害后，維持光合作用以及產(chǎn)生相應能量的能力是小麥在蟲害中是否能存活下來的決定因素[11]。

4.2 在植物發(fā)育方面的研究

生物體內大部分基因都是時空表達和誘導表達的結果，因此在植物不同發(fā)育時期，不同組織器官基因的表達不同。研究不同發(fā)育階段、不同組織器官基因的特異表達，對于了解生物的生長、發(fā)育和衰老等基本規(guī)律具有重要的意義。Lee J M等人利用含有重要代謝途徑和玉米幼胚cDNA克隆的芯片，研究玉米授粉后幼胚發(fā)育不同時期的基因表達變化，研究發(fā)現(xiàn)有一組基因在授粉后5～10 d,20～25 d,40～45 d內表達劇烈增加和授粉后表達逐漸減弱的基因，進而闡述玉米幼胚的發(fā)育規(guī)律[12]。Kim J Y等人用SSH篩選出香石竹花成熟過程中發(fā)育調控基因CFMI（Carnation flower maturationinduced），CFMI在香石竹花發(fā)育過程中有差異表達，并且優(yōu)先在花瓣與花柱中表達[13]。Schena M等人對擬南芥根部和莖部差異表達基因的研究，闡述植物根部和莖部產(chǎn)生形態(tài)和功能差異的原因[14]。Le Q等[15]和Derory J等[16]也分別利用該方法研究比較了細胞分化不同階段基因的表達情況和頂芽在萌發(fā)的不同階段基因的表達情況。

5 展望

隨著后基因組時代的到來，探索基因的功能逐漸成為熱門的研究課題。借助生物信息學、基因組學、蛋白質學等學科的迅猛發(fā)展，數(shù)據(jù)庫中成千上萬基因的功能被開發(fā)出來。將SSH和cDNA芯片技術結合起來進行基因表達差異的研究，在相當長的一段時間內都會有重要的應用前景。SSH方法是尋找差異表達基因的快速有效的方法，cDNA芯片是高通量篩選基因表達的方法，將SSH和cDNA芯片技術相結合，不僅彌補了SSH后續(xù)大量差減克隆繁重、Northern blot鑒定的不足，而且能較為真實地反映RNA的豐度差異，大大提高了工作效率。雖然SSH和cDNA芯片技術的結合還存在花費較高，對于樣本較多的研究對象很難普及的局限性，但是隨著人類基因組計劃和微生物全基因組測序的完成，SSH與基因芯片技術有機結合將促進差異基因的大規(guī)?？焖俸Y選，而且篩選到的特異片段序列可與相應的基因序列庫中的表達序列標簽進行同源比較，或通過計算機分析查找到基因的全序列，進而推測、鑒定基因表達蛋白的功能。這將為植物差異表達基因的分離與鑒定、重要性狀的基因克隆和功能分析、植物抗性機理等方面的研究提供新的手段，從而大大推動植物發(fā)育生物學、植物生理學和植物遺傳學等學科的發(fā)展。隨著技術本身的不斷改進并將這2種技術集成使用，對差異表達基因的克隆具有十分廣闊的應用前景。

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Application of Suppression Subtractive Hybridization Coupled with Gene Chip Technologies to Differential Expression Genes of Plant

CHEN Rugang,GONG Zhenhui,LU Minghui,LI Dawei,HUANG Wei

Suppression subtractive hybridization(SSH)and gene chip are two effective methods developed in recent years, which are used to screen all differential expression genes.However,SSH and gene chip have certain limitation respectively.It will be a perfect clone system when they are coupled with each other to exert their advantages and to make up their disadvantages.So in this article,the fundamentals,advantages and disadvantages of SSH and gene chip,the technique characteristic and the application of SSH coupled with gene chip to rapid identification differential expression genes in plant were reviewed.

Suppression subtractive hybridization(SSH);Gene chip;Differential expression genes;Application

10.3865/j.issn.1001-3547.2009.20.001

國家自然科學基金（30571262）；“十一五”國家科技支撐計劃（2006BAD01A7）；西北農(nóng)林科技大學“青年學術骨干支持計劃”（01140304）；西北農(nóng)林科技大學人才基金（01140508）

陳儒鋼（1978-），男，博士，講師，主要從事蔬菜育種與生物技術的研究。E-mail：rugangchen@126.com

鞏振輝，通信作者，教授，博士生導師，主要從事蔬菜種質資源與育種及生物技術的研究。E-mail：gzhh168@yahoo.com.cn

2009-05-20