饒毅萍

（汕頭職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東汕頭，515041）

黃瓜根際促生菌的促生效應(yīng)與防病作用

饒毅萍

（汕頭職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東汕頭，515041）

對(duì)黃瓜植物根際促生菌（PGPR）菌株的分離篩選、分類鑒定以及人們對(duì)其促生防病作用的應(yīng)用和防病機(jī)制的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述，以期為新型PGPR制劑的進(jìn)一步研制、開發(fā)和應(yīng)用提供參考。

黃瓜 植物根際促生菌（PGPR） 分離篩選 分類鑒定 促生防病作用

植物根際促生菌 （Plant Growth-promoting rhizobacteria，PGPR）是指植物根際的一類能直接或間接地對(duì)植物生長(zhǎng)起促進(jìn)作用，能夠抑制多種植物病害的有益細(xì)菌。自從1978年Burr等人首先在馬鈴薯上報(bào)導(dǎo)PGPR以來(lái)，國(guó)內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)包括熒光假單孢菌、芽孢桿菌、根瘤菌、沙雷氏屬等20多個(gè)種屬的根際微生物具有防病促生的潛能。最多的是假單胞菌屬 （Pseudomonas），其次是芽胞桿菌屬（Bacillus）、農(nóng)桿菌屬（Agrobacterium）、埃文氏菌屬（Eriwinia）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、巴斯德氏菌屬（Pasteuria）、沙雷氏菌 （Serratia）、腸桿菌（Enterobacter）等[1]。人們相繼報(bào)道了它們對(duì)馬鈴薯、甜菜、大豆、油菜、玉米、水稻、小麥、黃瓜等農(nóng)作物的促生防病作用。本文綜合敘述了PGPR對(duì)黃瓜的作用及其機(jī)制。

1 黃瓜PGPR菌株的分離和篩選

研究當(dāng)中的PGPR菌株，一般都是通過(guò)如下的步驟來(lái)獲得[2～3]。

采集種植蔬菜的老熟菜地的表層土，播種黃瓜種子，培育黃瓜幼苗。待子葉完全展開時(shí)，拔出黃瓜苗，抖落根上松散的附著土，將苗自根莖處剪斷。將根置于滅菌的0.2%的水瓊脂液中，在搖床中振蕩，得到根際土壤懸浮液。稀釋后涂于KMB培養(yǎng)基中，置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，后挑取不同類型典型單個(gè)菌落，經(jīng)KMB平板純化，標(biāo)記編號(hào)。此時(shí)得到的僅是黃瓜幼苗根際細(xì)菌。

接下來(lái)進(jìn)行促生菌的篩選。將消毒后的黃瓜種子浸泡于分離純化后的各細(xì)菌懸浮液中2 h，再在培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。與經(jīng)滅菌水處理的黃瓜種子作對(duì)比，3 d后測(cè)量根長(zhǎng)、下胚軸長(zhǎng)等。由于黃瓜種子細(xì)菌化后進(jìn)行培養(yǎng)，大多數(shù)種子的萌發(fā)受到抑制，或表現(xiàn)出與對(duì)照差異不大。其中對(duì)種子、根、下胚軸生長(zhǎng)有促進(jìn)作用的，初步認(rèn)為它們具有促生活性。接下來(lái)用盆栽試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。將初選效果好的細(xì)菌懸浮液處理的黃瓜種子，播于經(jīng)高壓濕熱滅菌菜園土中，對(duì)照用無(wú)菌水處理。然后在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察出苗率、生長(zhǎng)勢(shì)、存活苗數(shù)情況。出苗2周后取材，測(cè)定植株鮮質(zhì)量、干質(zhì)量和含水量，并比較。篩選出對(duì)生長(zhǎng)有明顯促進(jìn)作用的菌株，進(jìn)一步進(jìn)行田間試驗(yàn)，可獲得黃瓜根際促生菌株。

表1 CH1與CH2對(duì)黃瓜生長(zhǎng)影響[6]

表2 CH1與CH2對(duì)黃瓜幼苗組織中葉綠素、蛋白質(zhì)、可溶性糖和VC含量的影響[6] mg/g

可進(jìn)一步進(jìn)行促生菌的防病檢驗(yàn)。采用平皿對(duì)峙法，將上述篩選獲得的PGPR菌株與引起黃瓜猝倒病與枯萎病的瓜果腐霉（Pythiumaphanidermatum）、尖孢鐮刀菌 （Fusarium oxysporumf.sp．Cucumerinum）進(jìn)行拮抗試驗(yàn)。如進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，則將長(zhǎng)滿瓜果腐霉菌和鐮刀菌菌絲的麩皮培養(yǎng)基與滅菌土以1∶20的比例充分混勻后撒入種植有黃瓜苗的小缽中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，25 d后觀察并記錄成苗率、生長(zhǎng)與發(fā)病情況，根據(jù)結(jié)果篩選出促生防病菌株。

2 黃瓜PGPR菌株的分類鑒定

篩選出來(lái)的PGPR菌株的分類鑒定，傳統(tǒng)做法主要是根據(jù)表型特征和一般的生理生化特性。表型特征鑒定是根據(jù)斜面菌苔特征、平板菌落特征及顯微鏡下的染色圖像，再參考一般細(xì)菌的鑒定手冊(cè)等來(lái)進(jìn)行。此法由于缺乏足夠的細(xì)節(jié)資料而很難將細(xì)菌準(zhǔn)確鑒定至種。而利用生理生化特性[4]（溫度、pH值、所利用碳源、所產(chǎn)生色素、溶磷作用、固氮作用等）鑒定雖能較好地解決這一點(diǎn)，但由于所測(cè)試項(xiàng)目甚多，要求試驗(yàn)室內(nèi)大量的工作，因而相當(dāng)費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

陳曉斌等[5]利用美國(guó)BIOLOG公司生產(chǎn)的Microstation TM微孔板鑒定系統(tǒng) （簡(jiǎn)稱BIOLOG系統(tǒng))，則能對(duì)菌株的重要生理生化反應(yīng)作快速鑒定，從而較好的解決根際促生菌的分類鑒定問(wèn)題。利用BIOLOG系統(tǒng)，當(dāng)接種純培養(yǎng)的細(xì)菌懸液時(shí)，其中一些孔中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被利用，使孔中的氧化反應(yīng)指示劑四氮唑紫呈現(xiàn)出不同程度的紫色，從而構(gòu)成該種細(xì)菌的特有代謝指紋，經(jīng)相應(yīng)的儀器記錄，結(jié)果輸入BIOLOG配套軟件，與標(biāo)準(zhǔn)菌種的數(shù)據(jù)庫(kù)比較后，該菌株的分類地位便被確定出來(lái)。該方法具有快速、簡(jiǎn)便、高效、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。只要菌種庫(kù)資料充分，對(duì)細(xì)菌的鑒定一般可以精確至種。

3 PGPR對(duì)黃瓜生長(zhǎng)的影響及其原因探討

梁建根等[6]對(duì)于PGPR對(duì)黃瓜的促生效應(yīng)作了較多的試驗(yàn)研究。他們以分離篩選鑒定后的促生菌短芽孢桿菌CH1（Brevibacillus brevis）和枯草芽孢桿菌CH2（Bacillus subtilis）為材料，以無(wú)菌水為對(duì)照，分別研究了CH1和CH2對(duì)黃瓜種子萌發(fā)情況，黃瓜幼苗的出苗時(shí)間、植株高度、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、根長(zhǎng)和子葉大小情況的影響（表1）。繼而又取黃瓜幼苗的根部和葉部組織測(cè)定了超氧陰離子產(chǎn)生速率、H2O2含量、丙二醛（MDA）含量、葉片葉綠素含量、蛋白質(zhì)含量、可溶性糖含量，VC含量（表2），進(jìn)行分析討論。

黃瓜種子經(jīng)CH1與CH2處理后發(fā)芽率分別為96.0%和93.3%，與對(duì)照72.7%相比差異達(dá)顯著水平。進(jìn)一步結(jié)合表1的試驗(yàn)結(jié)果，可見(jiàn)CH1與CH2對(duì)黃瓜具有顯著的促生活性。

從表2來(lái)看，植物促生細(xì)菌CH1與CH2處理黃瓜后，與黃瓜品質(zhì)相關(guān)的生理指標(biāo)表明，CH1與CH2處理顯著地提高了黃瓜根部與葉部蛋白質(zhì)、可溶性糖和VC含量以及葉部葉綠素含量。研究者推測(cè)，植物促生細(xì)菌可能是通過(guò)不同程度地提高蛋白質(zhì)、可溶性糖、VC和葉綠素含量，從而間接影響黃瓜的生長(zhǎng)與品質(zhì)。

經(jīng)CH1與CH2處理后，黃瓜根部與葉部中超氧陰離子產(chǎn)生速率均比對(duì)照極顯著降低。根部與葉部的H2O2和丙二醛（MDA）含量均顯著低于對(duì)照。根據(jù)這2個(gè)生理指標(biāo)對(duì)植物的效應(yīng)，研究者認(rèn)為植物促生細(xì)菌CH1與CH2可能是通過(guò)降低黃瓜組織內(nèi)活性氧的含量來(lái)減少脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量的積累，消除MDA對(duì)黃瓜組織的傷害，從而增強(qiáng)黃瓜的抗逆性與適應(yīng)性，促進(jìn)黃瓜的生長(zhǎng)。辛樹權(quán)等[7]也持相同觀點(diǎn)。

4 PGPR對(duì)黃瓜的防病作用

許多的研究表明，PGPR對(duì)多種頑固性土傳病害（小麥全蝕病、馬鈴薯軟腐病、棉苗猝倒病、作物青枯病等）能有效地進(jìn)行防治[2]。對(duì)黃瓜而言，主要的土傳病害是由病原真菌腐霉屬的不同致病種（Pythiumspp．）引起的黃瓜猝倒病和由枯萎病菌（Fusariumspp．）不同致病種引起的枯萎病[3]。眾多研究者[2～3，8～10]通過(guò)平皿拮抗試驗(yàn)、盆栽試驗(yàn)和田間試驗(yàn)得出，PGPR對(duì)黃瓜猝倒病和枯萎病能發(fā)揮顯著的防治作用。并進(jìn)一步通過(guò)測(cè)定一些生理生化指標(biāo)來(lái)推測(cè)PGPR防病作用的原因。

大量的研究表明，參與植物體內(nèi)多種生理代謝過(guò)程的超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、多酚氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）等系列保護(hù)酶，與植物的防衛(wèi)反應(yīng)及抗病性密切相關(guān)，通常用作衡量植物體內(nèi)防衛(wèi)反應(yīng)的重要指標(biāo)[8]。梁建根等[8]研究表明，黃瓜經(jīng) CH1（Brevibacillus brevis） 處理并同時(shí)接種腐霉菌（Pythium aphanidermatum）后，處理根部與未處理葉部組織中SOD，POD，CAT，PPO和PAL活性都明顯高于其他處理。處理后28 d，猝倒病相對(duì)防效高達(dá)78.64%。推測(cè)促生菌CH1使黃瓜產(chǎn)生的誘導(dǎo)抗性是其防病的主要原因。而CH1誘導(dǎo)的黃瓜對(duì)猝倒病抗性可能與上述酶的活性的提高有一定的相關(guān)性。黃瓜可能通過(guò)提高這些酶活性，從而增強(qiáng)了黃瓜抵御病原菌侵入、蔓延的能力。梁建根等[9]研究了促生菌CH1和猝倒病菌瓜果腐霉接種黃瓜對(duì)其根部組織酚類物質(zhì)代謝的影響。結(jié)果表明，經(jīng)CH1誘導(dǎo)處理黃瓜根部組織后，苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）活性都明顯高于未經(jīng)CH1處理的。同時(shí)，經(jīng)CH1處理的植株根部阿魏酸、綠原酸、木質(zhì)素、總酚和類黃酮含量都高于未經(jīng)CH1處理的。從而推測(cè)，CH1通過(guò)提高黃瓜植株體內(nèi)酚類物質(zhì)代謝的酶活性來(lái)激發(fā)酚類物質(zhì)的積累，誘導(dǎo)黃瓜對(duì)猝倒病產(chǎn)生抗性。

人們不僅得出了PGPR有促生和防病的作用這一結(jié)論，研究了單一促生菌的促生防病效果，而且還進(jìn)一步研究了多種促生菌混合施用后的生態(tài)效應(yīng)。張昕等[10]將2個(gè)對(duì)黃瓜枯萎病菌（Fusarium axysporumf.sp.cucumerinum）有抑制作用，并能明顯促進(jìn)黃瓜生長(zhǎng)的菌株ZJY-1（Brevibacillus brevis）和ZJY-116（Bacillus subtilis）與一株毒死蜱（殺蟲劑）降解菌DSP3（Alcaligenes faecali）按照不同組合處理黃瓜種子，以研究多功能菌群在環(huán)境中發(fā)揮生態(tài)效應(yīng)的可行性。結(jié)果表明，3個(gè)細(xì)菌菌株互相之間不產(chǎn)生拮抗。ZJY-1，ZJY-116與DSP3按不同組合混合后，對(duì)黃瓜的防病促生作用均不受影響。但ZJY-1和ZJY-116混合施用后也沒(méi)有累加效應(yīng)。從黃瓜根圍土中毒死蜱含量檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，DSP3與這2株細(xì)菌混和施用后其降解率與單獨(dú)施用相比沒(méi)有明顯差異，且DSP3+ZJY-116的組合表現(xiàn)出更強(qiáng)的降解趨勢(shì)（殘留量最低，效果最佳）。試驗(yàn)證明，不同功能的菌株混合施用后可以發(fā)揮其生態(tài)效應(yīng)。大多數(shù)的研究表明混配制劑提高了生物防治的效果，但前提是混配菌株間表現(xiàn)為親和性[3]。

5 PGPR的促生防病機(jī)制

人們通過(guò)大量的試驗(yàn)研究證明，PGPR促生作用與防病作用具有一致性。黃曉東等[11～12]認(rèn)為PGPR通過(guò)以下的直接作用促進(jìn)作物的生長(zhǎng)：①分泌有機(jī)酸溶解磷并使之有效化；②自生固氮；③通過(guò)嗜鐵素增加植物鐵營(yíng)養(yǎng)；④產(chǎn)生植物激素（如生長(zhǎng)素、細(xì)胞激動(dòng)素和赤霉素等）；⑤調(diào)節(jié)植物體內(nèi)乙烯。另一方面，PGPR通過(guò)防治作物的病害，以間接作用途徑促進(jìn)作物的生長(zhǎng)：①產(chǎn)生抗生素抑制植物病原微生物；②清除植物根圍可供病原菌利用的鐵；③誘導(dǎo)激活植物自身抗御機(jī)能；④合成抗真菌代謝物；⑤與病原微生物爭(zhēng)奪根圍生存空間。其他眾多的相關(guān)報(bào)道也大多集中在以上這些方面。

由于PGPR具有改良土壤、改善作物品質(zhì)、減少化肥和農(nóng)藥使用量、降低植物病害、提高作物產(chǎn)量等作用 ，因此，其自身及與菌根真菌的協(xié)同作用在農(nóng)林牧業(yè)、食品安全、環(huán)境保護(hù)等方面具有重大應(yīng)用潛力和價(jià)值[13]。如今，人們對(duì)PGPR的研究重點(diǎn)主要集中在如何改善PGPR定殖能力、作用機(jī)理、適應(yīng)性、應(yīng)用的合理劑量、與殺蟲劑、除草劑、殺線蟲劑配合施用等一系列應(yīng)用基礎(chǔ)研究上。微生物制劑由單一功能向多功能發(fā)展（如肥藥合一），與礦質(zhì)元素或有機(jī)養(yǎng)分的合理復(fù)合等，也是當(dāng)前一個(gè)研究和發(fā)展趨勢(shì)。

[1]胡江春，薛德林，馬成新，等.植物根際促生菌（PGPR）的研究與應(yīng)用前景[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2004，15（10）：1963-1966.

[2]陳曉斌，張炳欣，樓兵干，等.根圍促生菌對(duì)黃瓜幼苗的促生效應(yīng)與防病作用[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，1999，25（6）：578-582.

[3]梁建根，張炳欣，施躍峰，等.植物根圍促生細(xì)菌（PGPR）的分離篩選及對(duì)黃瓜土傳病害的防治[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2007，23（12）：341-346.

[4]李梅，刁治民，趙子倩.青貯玉米促生菌的鑒定及生物學(xué)特性的研究[J].青海畜牧獸醫(yī)雜志，2001，31（1）：3-5.

[5]陳曉斌，張炳欣，樓兵干，等.BIOL0G系統(tǒng)鑒定黃瓜根圍促生菌的初步研究[J].微生物學(xué)通報(bào)，2000，27（6）：403-407.

[6]粱建根，張炳欣，喻景權(quán)，等.植物根圍促生細(xì)菌(PGPR)對(duì)黃瓜生長(zhǎng)及生理生化特性的影響[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2007，33（2）：202-206.

[7]辛樹權(quán)，趙驥民，何正飚，等.促生菌對(duì)黃瓜幼苗過(guò)氧化物酶活力的影響[J].長(zhǎng)春師范學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2008，27（1）：59-62.

[8]梁建根，張炳欣，陳振宇，等.促生菌CH1誘導(dǎo)黃瓜對(duì)猝倒病抗性的研究[J].園藝學(xué)報(bào)，2006，33（2）：283-288.

[9]梁建根，張炳欣，喻景權(quán).促生菌CH1對(duì)黃瓜酚類物質(zhì)代謝的影響及與抗猝倒病的關(guān)系[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2007，23（6）：462-466.

[10]張昕，張炳欣，趙宇華，等.多功能菌群混合施用的生態(tài)效應(yīng)[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2005，16（10）：1909-1912.

[11]黃曉東，季尚寧，Bernard Glick，等.植物促生菌及其促生機(jī)理[J].現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)，2002（275）：7.

[12]黃曉東，季尚寧，Bernard Glick，等.植物促生菌及其促生機(jī)理[J].現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)，2002（276）：13-15.

[13]戴梅，宮象輝，叢蕾，等.PGPR制劑研發(fā)現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì)[J].山東科學(xué)，2006，19（6）：45-48.

Disease Prevention and Growth Promoting Effect of Growth-promoting Rhizosphere in Cucumber

RAO Yiping
(Shantou Vocational and Technical College,Shantou,Guangdong 515041)

At present,the development,exploiture and the application of the new PGPR are one hotspot directions of microorganism development.The isolation,screen,classfication,identification as well as the achivements were reviewed in disease prevention of cucumber PGPR strain were reviewed.

Cucumber;Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR);Isolation selection;Calssification;Identification; Disease prevention

10.3865/j.issn.1001-3547.2009.14.004

饒毅萍（1974-），女，講師，主要從事微生物學(xué)和植物學(xué)的教學(xué)和研究工作，電話：0754-88879307,13682989659。E-mail：szyryp＠163.com

2009-02-12