吳承瓊　周　洪　王曉榮

[摘要]目的：研究持續(xù)靜壓力(continuously compressive pressure,CCP)對人牙周膜成纖維細胞(human periodontal ligament cells,HPDLs)核因子受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand,RANKL)分泌活性的影響，初步探討其在正畸性骨改建中的作用機制。方法：用組織塊酶消化法培養(yǎng)獲得人牙周膜成纖維細胞。建立空氣靜壓力加載模型，分別對細胞加載0、50、100、150、200持續(xù)靜壓力0、0.5、1、1.5、2、4、6、12h，利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應法(reverse transcription-polymerase chain reation,RT-PCR)檢測RANKLmRNA分泌活性的變化。 結(jié)果：牙周膜細胞在持續(xù)靜壓力作用下RANKLmRNA表達增強，100Kpa加壓1.5h時，RANKLmRNA的表達達峰值。結(jié)論：持續(xù)靜壓力可上調(diào)人牙周膜成纖維細胞RANKLmRNA的表達。

[關(guān)鍵詞]牙周膜細胞；靜壓力；核因子受體活化因子配體；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應

[中圖分類號]R783.5[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2009）02-0210-04

Effect of continuously compressive pressure on espression of RANKLmRNAin human periodontal ligament fibroblast in vitro

WU Cheng-qiong,ZHOU Hong,WANG Xiao-rong

（Department of Orthodontics,the Affiliated Stomatological Hospital,Medical School of Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710004,Shaanxi,China)

Abstrcat:ObjectiveTo study the effect of continuously compressive pressure(CCP) on the expression of receptor activator of nuclear factor kappa B ligand(RANKL) in human periodontal ligament cells(HPDLs),and to investigate the role of continuously compressive pressure in alveolar bone rebuilding during orthordontic tooth movement. MethodsHPDLCs were isolated from human periodontal ligament by explanting enzymatic digestion with trypsin and collagenase. Estanblish a pressure model ,sustained static pressure 0Kpa、50 Kpa、100 Kpa、150 Kpa、200 Kpa were laid on HPDLCs for 0h、0.5h、1h、1.5h、2h、4h、6h、12h, respectively. The RANKL expression was identified by reverse transcription-polymerase chain reation(RT-PCR). Results The expression of RANKLmRNA significant increased after pressure exposed, especially in the group of 100 Kpa pressure lasted for 1.5 hours. ConclusionCCP can up-regulate the expression of RANKLmRNA in HPDLFs.100 Kpa pressure lasted for 1.5 hours was the suitable condition.

Key words: human periodontal ligament fibroblasts;continuously compressive pressure;RANKL;RT-PCR

正畸牙移動是一個復雜的機械生物學反應過程，牙周組織感應力學刺激后所發(fā)生的組織改建是牙齒移動的基礎(chǔ)。牙周膜細胞是正畸矯治力的直接感應細胞[1]，能將所受到的機械應力轉(zhuǎn)化為細胞內(nèi)外的生物化學信號，又是正畸力的效應細胞[2]，在外力的作用下可分泌并釋放多種細胞因子，同時參與了骨吸收和骨形成的過程。體外實驗證明對牙周膜細胞施加機械力，細胞表達RANKL增強，RANKL作為骨吸收過程中的關(guān)鍵因子，在破骨細胞的分化和活化過程中其著重要的作用。近年來，RANKL已作為骨代謝途徑的關(guān)鍵因子而被廣泛關(guān)注。本實驗通過對HPDLFs施加不同大小和不同作用時間的持續(xù)靜壓力，觀察靜壓力條件下RANKL表達活性變化，尋找誘導牙周膜細胞在齒槽骨改建中發(fā)揮作用的最佳作用力值和作用時間。

1材料和方法

1.1試劑及儀器：主要試劑有：DMEM培養(yǎng)基（低糖）（GIBCO公司，美國）、胎牛血清FBS（灝洋，天津）、0.25%胰蛋白酶（Sigama公司，美國）、SABC免疫組化試劑盒、波形絲蛋白單克隆抗體，角蛋白單克隆抗體（博士德公司，杭州）、I型膠原酶（Sigama公司，美國）；主要儀器有：全自動高壓滅菌鍋HV-50 (HIRAYAMA,日本)；低溫高速離心機(3K18) (Sigma,德國)；倒置顯微鏡 (Nikon, 日本)；CO2培養(yǎng)箱(BB16) (Heraeus,美國)；超凈工作臺(BCM-100A) (中國，蘇州)；空氣靜壓力細胞加載系統(tǒng)（自制）。PCR擴增儀（9700型）(ABI，美國）；電泳儀（EPS-301）（Amersham，瑞典）。

1.2 HPDLCs的培養(yǎng)與鑒定：取西安交通大學口腔醫(yī)院口外門診12～18歲健康青少年因正畸拔除的第一前磨牙，刮取牙根中1/3的牙周膜組織后剪碎，1 200r/min離心5min，棄上清，加入2g/L的I型膠原酶1～2mL，吹打混勻，置于37℃恒溫箱中消化30min，每隔5min振蕩搖勻一次。當肉眼觀察到液體渾濁，組織塊明顯變小時加入含F(xiàn)BS150mL/L的DMEM培養(yǎng)液終止消化，1 200r/min離心5min，棄上清，加入DMEM培養(yǎng)液重懸后置于塑料培養(yǎng)瓶中，37℃、50mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后加培養(yǎng)液至3mL，獲得原代細胞，每3～4天換液。將細胞傳至第4代備用，以波形絲蛋白抗體和角蛋白抗體染色鑒定細胞。

1.3 HPDLCs靜壓力加載模型的建立：實驗用傳代培養(yǎng)的第四代人牙周膜細胞，等細胞生長至對數(shù)生長期時，全量更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)12h，把細胞培養(yǎng)瓶放入壓力加載裝置的密閉容器里，旋松培養(yǎng)瓶蓋；調(diào)整容器內(nèi)溫度為37℃，檢查裝置后，對各實驗組施加0、50、100、150、200Kpa的持續(xù)靜壓力作用0、0.5、1、1.5、2、4、6、12h，加力完成后立即收集細胞和條件培養(yǎng)液。-70℃冰箱保存。

1.4 RT-PCR檢測細胞RANKLmRNA的表達

1.4.1細胞總RNA的提?。喊磘rizol試劑盒說明提取細胞總RNA。在紫外分光光度計上分別讀取260nm、280nm的OD值以檢測RNA的純度和濃度。

1.4.2 引物設(shè)計與合成：引物由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成。（見表1）

1.4.3 cDNA的合成：按試劑盒說明，配置RT反應液，試劑配好后，輕輕混合均勻，低速離心數(shù)秒，將PCR反應管放置到PCR擴增儀上進行RT反應。反應條件：25℃ 10min，50℃ 45min（反轉(zhuǎn)錄反應），95℃ 5min（滅活逆轉(zhuǎn)錄酶），4℃ 5min。

1.4.4 PCR擴增：按照試劑盒說明配置PCR反應液，擴增條件為：94℃預變性3min，然后94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min共35個循環(huán)，72℃徹底延伸10min，4℃保存。

1.4.5 積分光密度值的測定：用0.5%的TAE緩沖液配制1%瓊脂糖凝膠，將PCR的反應產(chǎn)物各5μl在瓊脂糖凝膠中電泳，電泳結(jié)束后在自動凝膠成像儀觀察結(jié)果，照相，對電泳的結(jié)果進行圖像灰度分析。

1.5 統(tǒng)計學處理：用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，分別以時間和力值因素分組，作單因素方差分析，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1 牙周膜細胞的培養(yǎng)及鑒定：在倒置相差顯微鏡下觀察，可見大多數(shù)細胞呈長梭形，為單核細胞，有長短不一的數(shù)個細胞突起，胞體豐滿，胞核橢圓形、居中，胞漿豐富，細胞貼壁生長，此為牙周膜成纖維細胞（如圖1A）。波形絲蛋白染色呈陽性，胞漿棕黃色著色；角蛋白染色陰性（如圖1B）。

2.2 加力后細胞形態(tài)觀察：牙周膜細胞加力后，生長良好，細胞排列整齊致密，呈長梭形，少數(shù)細胞變圓。（如圖2）

2.3 RNA純度檢測：經(jīng)測量，RNA純度及濃度均較高，符合PCR試驗要求。

2.4 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果和積分光密度值 ：PCR產(chǎn)物電泳條帶清晰，無明顯雜帶，條帶位置與引物設(shè)計相符。圖3A為100 Kpa加力組RANKLmRNA的表達變化，加力時間從左到右依次為0、0.5、1.0、1.5、2、4、6、12h。加力后RANKLmRNA的表達增加，加力1.5h時增至最大，隨后又下降。圖3B為1.5h組RANKLmRNA的表達變化，從左到右，加力大小依次為0、50、100、150、200Kpa。加力后RANKLmRNA的表達增加，加力100 Kpa時增至最大，隨著力值的繼續(xù)增大，RANKLmRNA的表達反而下降。

測量各電泳帶的OD值，以內(nèi)參β-actin mRNA為參照，計算出RNKL/β-actin OD比值。分別以時間和力值因素分組，作單因素方差分析，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。分別以力值和時間分組，分析OD比值的變化：各力值組加力后，OD比值均上升，加力1.5h時，OD比值升高達峰值。隨后OD比值反而下降。就力值大小比較，不同加力時間組加力后，OD比值均上升，力值為100Kpa時，OD比值最大，隨力值增大，OD比值反而下降。（如圖4～5）

3討論

正畸牙齒移動的生物學基礎(chǔ)是牙周組織的改建，而牙周組織改建成功的關(guān)鍵則取決于牙周膜中參與組織再生的細胞-牙周膜細胞。牙周膜細胞位于牙與牙槽骨之間，是正畸力的直接效應細胞。在機械應力作用下，牙周膜細胞做出相應的應激反應，從而調(diào)控牙槽骨的形成或吸收。大多數(shù)學者[3]的研究表明牽張力作用可使得牙周膜細胞成骨作用增加。而迄今為止，很少有學者單獨利用體外培養(yǎng)細胞的方法研究牙周膜細胞對機械壓力的反應，因此，機械壓力和骨吸收之間的關(guān)系以及在骨組織中如何在特定的部位形成骨吸收陷窩的機制仍不十分清楚。Kanzaki[4]首次將牙周膜細胞和外周血單核細胞共培養(yǎng)后施加機械壓力，發(fā)現(xiàn)牙周膜細胞內(nèi)RANKL mRNA的含量增加。黃生高，張建興[5]等發(fā)現(xiàn)對人牙周膜細胞施加壓力后人牙周膜細胞內(nèi)RANKLmRNA 升高，且呈時間依賴性。推測，當人牙周膜細胞在體內(nèi)感受到正畸壓力后，經(jīng)過一系列的信號轉(zhuǎn)換，細胞內(nèi)RANKLmRNA表達增強，RANKL蛋白合成增加，細胞表面RANKL的表達也隨之增加，召集牙周膜內(nèi)外周血單核細胞并與之接觸，在巨噬細胞集落刺激因子的共同作用下使之增殖、分化為破骨前體細胞，并進一步分化為破骨細胞，從而啟動了壓力側(cè)的骨吸收。

RANKL是近年來研究較多的骨代謝因子，在骨和骨髓微環(huán)境中，RANKL的主要來源是骨髓基質(zhì)細胞、成骨細胞、牙周膜細胞、軟骨細胞。直接參與骨代謝的RANKL由成骨/基質(zhì)細胞分泌，通過旁分泌方式發(fā)揮作用，RANKL的主要作用機制是與成熟破骨細胞胞膜表面的核因子-кB受體活化因子（RANK)相結(jié)合，刺激破骨細胞分化，加強成熟破骨細胞的活性，抑制破骨細胞的凋亡，RANKL能直接誘導破骨細胞分化發(fā)育并參加破骨細胞功能調(diào)節(jié)，參與破骨細胞分化、融合、生存、激活的全過程[6-8]。同時成骨細胞/牙周膜細胞還分泌骨保護素（OPG），OPG可以與RANKL結(jié)合，競爭性的抑制破骨細胞的分化和活化[9]。機體調(diào)節(jié)通過RANKL和OPG的合成比例來調(diào)節(jié)破骨細胞的形成和活化以調(diào)節(jié)骨吸收平衡。

細胞動力學是現(xiàn)代生物力學發(fā)展的前沿領(lǐng)域，其研究基礎(chǔ)和關(guān)鍵是細胞加載技術(shù)，體外細胞加載裝置的建立，使我們能夠?qū)毎隗w外受力后發(fā)生的結(jié)構(gòu)、功能及代謝的改變進行深入細致的研究。1939年，Glucksmann在體外細胞力學加載方面，進行了開拓性的研究。1975年Rodan等開創(chuàng)了機械應力作用培養(yǎng)細胞和組織相關(guān)研究的新時代。經(jīng)過多年的改進和發(fā)展，已研制出多種體外細胞加力裝置[10-11]。大致分為：離心力加載、流體加載、單個細胞加載、壓力傳導加載、基底膜形變加載和空氣靜壓力加載等裝置。本實驗選擇由Banes設(shè)計的真空操作裝置并加以改良，解決了以往對體外細胞加力方法不足的問題。該裝置可以提供靜壓力和間歇性可變壓力兩種方式，在氣體靜壓力作用下，每個細胞受力大小均勻，壓力值肯定，壓力調(diào)節(jié)范圍大，且操作簡單，是一種較為理想的加力裝置。

牙周膜細胞在牙槽骨改建中起著極其重要的作用，在對牙周膜細胞生物力學研究中要不斷改進細胞體外培養(yǎng)技術(shù)，不斷尋找最佳的加力裝置和最適宜的加載條件，以便于在細胞生物力學研究中取得新的成果。本實驗選取牙周膜細胞表達的最關(guān)鍵的骨代謝因子RANKL，通過對牙周膜細胞施加不同大小和不同加載時間的持續(xù)靜壓力，檢測牙周膜細胞中RANKLmRNA的表達變化，以尋找誘導牙周膜細胞在齒槽骨改建中發(fā)揮作用的最佳作用力值和產(chǎn)生作用時間。通過對牙周膜細胞施加不同大小和作用時間的持續(xù)靜壓力，發(fā)現(xiàn)牙周膜細胞在受到100Kpa的持續(xù)靜壓力作用1.5h后，RANKLmRNA的表達最高，100Kpa，1.5h的加載條件有利于研究牙周膜細胞在骨吸收過程中的作用。

本實驗通過對體外培養(yǎng)的人牙周膜成纖維細胞施加一定持續(xù)靜壓力，檢測人牙周膜細胞中RANKLLmRNA表達變化，尋找靜壓力對牙周膜細胞最佳的作用力值和加力時間，為以后實驗壓力加載提供指導，為進一步研究壓力刺激下，牙周膜細胞誘導破骨細胞生成的信號轉(zhuǎn)導通路奠定了基礎(chǔ)；對于臨床工作中提高治療效果、縮短治療時間也有著重要的指導意義。

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[收稿日期]2008-11-20[修回日期]2009-01-09

編輯/何志斌