李　丹　喬　群　王曉軍　曾　昂

[摘要]目的：探討腺病毒載體介導(dǎo)外源基因經(jīng)動(dòng)脈灌注轉(zhuǎn)移修飾大鼠腹壁淺動(dòng)脈島狀皮瓣（Superficial inferior epigastric artery flap，SIEA）的可行性、安全性并對(duì)其轉(zhuǎn)染條件作出評(píng)價(jià)。方法： 本研究通過血管夾暫時(shí)夾閉形成局部封閉環(huán)境，應(yīng)用腺病毒介導(dǎo)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因 (Ad5-CMV-EGFP) 經(jīng)動(dòng)脈灌注帶蒂SIEA 60min。60只SD大鼠隨機(jī)分為6組： A、B、C、D組分別為：3.0×106、3.0×107、3.0×108、3.0×109pfu/ml，E組：PBS、F組：腺病毒空載體。術(shù)后7天應(yīng)用活體熒光成像系統(tǒng)觀察皮瓣的熒光強(qiáng)度，應(yīng)用共聚焦顯微鏡、RT- PCR檢測(cè)皮瓣組織中EGFP的表達(dá)和分布情況，通過組織學(xué)分析對(duì)皮瓣的安全性影響。結(jié)果：術(shù)后7天B組、C組、D組活體觀察皮瓣可見體表綠色熒光信號(hào)。共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果與活體觀察結(jié)果一致，EGFP在皮瓣內(nèi)血管內(nèi)、外膜均可見表達(dá)，血管周圍組織包括脂肪、毛囊可見EGFP表達(dá)，皮瓣外組織未見EGFP 表達(dá)。對(duì)照組E組、F組未見EGFP表達(dá)。RT-PCR結(jié)果顯示，EGFP僅在皮瓣內(nèi)表達(dá)，其他重要臟器（心臟、肝臟、腎臟）無表達(dá)。對(duì)皮瓣組織學(xué)觀察未見明顯炎癥反應(yīng)。結(jié)論：復(fù)合組織瓣轉(zhuǎn)移修復(fù)創(chuàng)面是一種成熟的手術(shù)方式。本研究從大體觀察、組織形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)三方面評(píng)價(jià)外源基因經(jīng)動(dòng)脈內(nèi)灌注轉(zhuǎn)染大鼠帶蒂皮瓣的可行性,為進(jìn)一步深入研究基因修飾復(fù)合組織瓣，使其發(fā)揮治療性修復(fù)創(chuàng)面作用提供理論依據(jù)

[關(guān)鍵詞]腹壁淺動(dòng)脈皮瓣；外源基因；經(jīng)動(dòng)脈灌注；腺病毒

[中圖分類號(hào)]Q343.6[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]Ａ[文章編號(hào)]1008-6455（2009）02-0197-05

Adenovirus mediated exgenous gene transfect rat's SIEA flap by intra-artery perfusion

LI Dan，QIAO Qun，WANG Xiao-jun，ZENG Ang

（Plastic & Aesthetic Surgery Center, Peking Union Medical College Hospital，Peking Union Medical College, Beijing 100032,China）

Abstract:ObjectiveTo study the feasibility of superficial inferior epigastric artery (SIEA) flap transfected by intra-artery perfusion with exogenous gene mediated by adenovirus, and assess the transfect efficiency and optimal conditions.Methods： In our study ,rat's SIEA flap is transfected by intra-artery perfusion with exogenous enhanced gene-green florescent protein mediated by adenovirus (Ad5-CMV-EGFP) for 60 min . 60 Sprague Dawley rats were randomly divided into 6 groups: A (3.0×106pfu/ml), B(3.0×107pfu/ml), C (3.0×108pfu/ml), D(3.0×109pfu/ml), E(PBS), F(Adenovirus),and assess the transfect efficiency and optimal conditions. Under the optimal conditions, various components of SIEA flaps and the expressions of exogenous genes in adjacent tissue are observed to evaluate the effects of this transfect model to the whole system. At the 7th day of post operation, EGFP expression in tissue was detected by IVIS Imaging System, laser scanning confocal microscope and RT-PCR .Histological evaluation was used to assess toxicity.Results:The expression of EGFP was detected by IVIS Imaging System in group B, group C, group D at the 7th day of post operation. The result detected by fluorescence microscopy was similar to IVIS Imaging System. Ad5-CMV-EGFP.EGFP expression was comfirmed in the flap's intima, and perivascular tissue including adipose tissue, follicles. The result of RT-PCR shows that the sequence of EGFP is observed in flap, but no EGFP was observed in heart、liver or kidney. Histological evaluation of the flap revealed no evidence of inflammation in the treated group.ConclusionWound reconstruction by using microvascular flaps is a mature measure in plastic surgery. In this research, the author study the feasibility to transfect exogenous genes to rat's pedicle by intra-artery perfusion. By doing this, we can further study the genetically modified microvascular pedicle flaps ,and provide theoretic references for applying pedicle composite tissue flap to perform therapeutic and reconstructive functions.

Key words：superficial inferior epigastric artery(SIEA) flap; exogenous gene; intra-artery perfusion; adenovirus

復(fù)合組織瓣在難愈創(chuàng)面及體表腫瘤切除后的修復(fù)重建過程中發(fā)揮重要作用。通過對(duì)復(fù)合組織瓣進(jìn)行基因修飾等手段而達(dá)到基因治療的目的,是目前整形外科的研究熱點(diǎn)之一。有穩(wěn)定血管供應(yīng)的復(fù)合組織瓣是良好靶組織，其微血管床是基因經(jīng)動(dòng)脈灌注轉(zhuǎn)染的理想模型。動(dòng)脈內(nèi)灌注目的基因高效轉(zhuǎn)染修飾局部組織，使其表達(dá)治療蛋白，在移植醫(yī)學(xué)及介入醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已有報(bào)道[1]，但在整形外科領(lǐng)域報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)利用大鼠帶蒂腹壁淺動(dòng)脈皮瓣（Superficial inferior epigastric artery flap，SIEA）動(dòng)物模型，探討腺病毒載體介導(dǎo)外源基因（Ad5-CMV-EGFP）經(jīng)動(dòng)脈介入灌注轉(zhuǎn)染復(fù)合組織瓣的可行性、安全性并對(duì)其轉(zhuǎn)染條件做出評(píng)價(jià)。

1材料和方法

1.1腺病毒載體：Ad5-CMV-EGFP 為含巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(CMV) 的編碼增強(qiáng)型綠色熒光蛋白( EGFP) 基因的血清5 型重組腺病毒載體,由北京本原正陽基因技術(shù)有限公司提供,腺病毒滴度為9×109pfu/ml，實(shí)驗(yàn)前用磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋成滴度為3.0×106pfu/ml、3.0×107pfu/ml、3.0 ×108pfu/ml、3.0×109pfu/ml溶液備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康SD大鼠48只，雄性，體重0.35～0.40kg，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于北京協(xié)和醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)條件SPF級(jí)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被隨機(jī)分為6組，每組8只，A組：3.0×106pfu/ml，B組：3.0×107pfu/ml，C組：3.0×108pfu/ml，D組：3.0×109pfu/ml，E組：PBS，F(xiàn)組：腺病毒空載體。

1.3 基因經(jīng)動(dòng)脈轉(zhuǎn)移至SIEA皮瓣動(dòng)物模型制備：應(yīng)用戊巴比妥鈉（40mg/kg）腹腔注射大鼠麻醉成功后，腹股溝和腿部備皮，應(yīng)用標(biāo)記筆在腹股溝動(dòng)脈搏動(dòng)點(diǎn)處設(shè)計(jì)1.5cm×1.5cm 大小皮瓣，并設(shè)計(jì)向下肢延伸約2cm長切口線（圖1）。依次剪開皮膚及皮下組織，深達(dá)腹肌肌膜表面，即皮瓣由皮膚和肉膜組成，形成以腹壁淺動(dòng)靜脈為單一血供的帶蒂SIEA皮瓣（圖2）。隨后在腹壁淺動(dòng)靜脈根部分離股動(dòng)靜脈，應(yīng)用血管夾夾閉股動(dòng)脈發(fā)出腹壁淺動(dòng)脈根部周圍的分支及股動(dòng)、靜脈，暫時(shí)阻斷皮瓣血運(yùn)，在腹壁淺動(dòng)、靜脈分支處以遠(yuǎn)0.5cm處將微套管針插入股動(dòng)脈，應(yīng)用血管夾固定股動(dòng)脈與套管針后，套管針接口端接微量灌注泵。皮瓣首先用5mlPBS通過動(dòng)脈灌注，同時(shí)保持股靜脈近心端不被鉗夾狀態(tài)，可以使血液從皮瓣血管床中排出。將皮瓣放入無菌培養(yǎng)皿，以溫鹽水紗布襯墊，將Ad5-CMV-EGFP 0.5ml注入1ml注射器，接微量灌注泵，以120mmHg壓力開始進(jìn)行灌注時(shí)，將股靜脈近心端應(yīng)用血管夾夾閉，使皮瓣保持局部封閉狀態(tài)，以溫鹽水紗布包裹皮瓣，孵育60min后，釋放套管針插口處血管夾，應(yīng)用11-0絲線間斷對(duì)合縫合股動(dòng)脈殘留插口，隨后釋放腹壁淺動(dòng)靜脈血管蒂周圍全部血管夾，使腹壁下動(dòng)脈皮瓣恢復(fù)正常血供。原位分層縫合肉膜及皮膚組織。

1.4 標(biāo)本采集及檢測(cè)指標(biāo)：術(shù)后第7天，從大體觀察、組織形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)三方面評(píng)價(jià)外源基因在對(duì)A、B、C、D、E、F6組SD大鼠帶蒂SIEA皮瓣的表達(dá)和分布情況[2]。

1.4.1 活體檢測(cè)：將各組SD大鼠分別應(yīng)用戊巴比妥鈉（40mg/kg）麻醉成功后，腹股溝及下肢應(yīng)用電動(dòng)剃毛器備皮，放入活體熒光成像系統(tǒng)（IVIS，USA）,大體觀察SIEA皮瓣綠色熒光蛋白表達(dá)情況并拍照，應(yīng)用living image 3.0圖像分析軟件得出綠色熒光蛋白熒光強(qiáng)度。

1.4.2 標(biāo)本采集后檢測(cè)：活體檢測(cè)后實(shí)驗(yàn)鼠均應(yīng)用過量戊巴比妥腹腔注射處死，快速切取皮瓣組織，自中央剖開，一部分組織經(jīng)液氮速凍放入-80℃冰箱保存，用于逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測(cè)，另一部分組織OCT 包埋后立即放入液氮中速凍后，應(yīng)用恒冷箱冰凍切片機(jī)（Leica，CM1900）切成10μm切片，-80℃保存,用于熒光顯微鏡觀測(cè)，冰凍切片剩余組織放入4%多聚甲醛溶液固定24h，石蠟包埋后，應(yīng)用石蠟切片機(jī)（Leica，RM2145）切成7μm切片，行HE染色后光鏡檢測(cè)。

1.4.2.1 共聚焦顯微鏡觀察：激光共聚焦顯微鏡（Leica，TCS SP2）檢測(cè)EGFP表達(dá)及分布情況，掃描分辨率為1024×1024 pixel,計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集，數(shù)字成像。應(yīng)用IPP6.0圖像軟件計(jì)算灰度值。

1.4.2.2 RT-PCR檢測(cè)：Purescript RNA提取試劑盒(Gentra，USA)提取皮瓣組織中總RNA，然后用RT-PCR試劑盒(Gentra，USA)一步法檢測(cè)RNA樣品中的EGFP基因表達(dá)水平。應(yīng)用軟件設(shè)計(jì)引物，正義引物5'TGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTT3'，反義引物5'TGTTCTGCTGGTAGTGGTCGGC3'，擴(kuò)增長度555bp(上海生工公司合成)。將提取的1μg總RNA樣品和RT-PCR試劑盒中試劑混合，建立50μl 的RT-PCR反應(yīng)混合體系，在PCR儀(Biometra)進(jìn)行反應(yīng)，取10μlPCR產(chǎn)物上樣，1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀(Tanon)檢測(cè)RT-PCR結(jié)果并拍照。

1.4.2.3 光鏡觀察：應(yīng)用倒置顯微鏡（Leica，MPS 30）觀察HE染色切片中皮瓣組織結(jié)構(gòu)及炎性細(xì)胞浸潤情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析，應(yīng)用t檢驗(yàn)檢測(cè)組間差異，并以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x±s)表示，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 大體觀察：術(shù)后第7天，48只SD大鼠中2只出現(xiàn)皮瓣自噬現(xiàn)象，從實(shí)驗(yàn)中剔除。B組、C組、D組通過活體成像系統(tǒng)觀察皮瓣可見體表綠色熒光信號(hào)，其中D組綠色熒光信號(hào)最為明顯。A組、E組、F組未見體表綠色熒光信號(hào)，表明腺病毒空載體（F組）、PBS（E組）和過低滴度的3.0×106pfu/ml Ad5-CMV-EGFP（A組）均無法正常表達(dá)EGFP（表1）。

2.2 共聚焦顯微鏡觀察：術(shù)后7天，對(duì)照組E組、F組SIEA皮瓣中未見明顯自主熒光物質(zhì)。B 組、C組、D組共聚焦顯微鏡下可見EGFP信號(hào)，其中D組（Ad5-CMV-EGFP 3.0×109pfu/ml）在SIEA皮瓣組織的所有類型細(xì)胞中EGFP基因均有表達(dá)，內(nèi)皮細(xì)胞有最好的轉(zhuǎn)染表達(dá)量，在動(dòng)脈的內(nèi)膜層可見強(qiáng)烈的綠色熒光，外膜層可見。緊鄰血管外的細(xì)胞可見EGFP表達(dá)，表示經(jīng)血管灌注的Ad5-CMV-EGFP從血管內(nèi)逸出，并能夠擴(kuò)散至鄰近的實(shí)質(zhì)組織中，多數(shù)內(nèi)皮細(xì)胞可以有效的轉(zhuǎn)染（＞90%），肉膜中肌細(xì)胞（40%），脂肪細(xì)胞（30%），角質(zhì)細(xì)胞及毛囊細(xì)胞（20%）（圖3）。與Ad5-CMV-EGFP高滴度（3.0×109pfu/ml）且EGFP表達(dá)最為明顯的D組相比，A組在Ad5-CMV-EGFP 3.0×106pfu/ml滴度，未見明顯EGFP表達(dá)。

2.3 RT-PCR 檢測(cè)：轉(zhuǎn)染后7天， D組SIEA皮瓣組織樣品可見在500～700bp之間有1條清晰泳帶，約550bp，與Ad5-CMV-EGFP 質(zhì)粒組的EGFP cDNA 大小相一致，說明經(jīng)動(dòng)脈灌注Ad5-CMV-EGFP轉(zhuǎn)染SIEA皮瓣組織后7天，EGFP 基因在mRNA 水平有表達(dá)，而在皮瓣周圍組織未發(fā)現(xiàn)EGFP基因表達(dá)。另外D組隨機(jī)取2只SD大鼠的肝臟、心臟和腎臟組織經(jīng)RT-PCR 檢測(cè)均未見EGFP mRNA 的表達(dá)（圖4）。E組、F組SIEA皮瓣組織樣品均未見EGFP mRNA 表達(dá)。

2.4 組織病理學(xué)檢查：術(shù)后第7天，光鏡下實(shí)驗(yàn)組A、B、C、D組SIEA皮瓣內(nèi)血管外膜周圍可見少量淋巴細(xì)胞浸潤，但無明顯血管炎表現(xiàn)及水腫表現(xiàn)，組織結(jié)構(gòu)清晰。對(duì)照組E、F組可見少量中性粒細(xì)胞浸潤，類似輕度非特異性炎癥反應(yīng)。

3討論

近年來，針對(duì)復(fù)合組織瓣進(jìn)行的基因治療研究十分活躍，主要分為兩種治療方式，即間接體內(nèi)法(Ex vivo)和體內(nèi)法(In vivo)[2]。間接體內(nèi)法是從患者身上獲取細(xì)胞，在體外進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，將目的治療基因通過載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)過轉(zhuǎn)基因的篩選和擴(kuò)增后將獲得目的治療基因的細(xì)胞送回患者體內(nèi)，這是基因治療前期最常用的方法。體內(nèi)法是將外源基因裝配于特定的真核細(xì)胞表達(dá)載體中，然后利用載體系統(tǒng)直接導(dǎo)體內(nèi)。目前對(duì)體內(nèi)法研究日益增多，成為基因治療最有前途的方法。體內(nèi)基因治療復(fù)合組織瓣的給藥途徑主要有三種：局部注射、經(jīng)靜脈注射系統(tǒng)給藥、經(jīng)動(dòng)脈灌注給藥。由于經(jīng)靜脈注射系統(tǒng)給藥后能夠到達(dá)局部的較少；局部注射相對(duì)應(yīng)用較為廣泛，但局部注射造成的機(jī)械壓力損傷和基因表達(dá)不均勻等缺陷限制了它們?cè)诨蛑委熤腥〉米罴训寞熜3]。1998 年Taub PJ 首次報(bào)道應(yīng)用VEGFcDNA經(jīng)動(dòng)脈灌注腹部缺血皮瓣，提高缺血皮瓣的存活面積[4-5]，是復(fù)合組織瓣經(jīng)動(dòng)脈灌注基因治療的雛形。復(fù)合組織瓣經(jīng)動(dòng)脈灌注其微血管床后，可以作為目的基因表達(dá)載體并最終產(chǎn)生目的蛋白。與局部注射和全身轉(zhuǎn)染的方法相比，經(jīng)動(dòng)脈灌注復(fù)合組織瓣的方法局部靶向性更強(qiáng)并且更加有效。

大鼠SIEA皮瓣是整形外科常用的皮瓣研究對(duì)象，其組織結(jié)構(gòu)中包含表皮、真皮全層皮膚以及薄層肉膜結(jié)構(gòu)，可以作為復(fù)合組織瓣進(jìn)行研究[6]。1984年P(guān)etry JJ和Wortham KA詳細(xì)報(bào)道了大鼠SIEA皮瓣的解剖，其直接血供為腹壁淺動(dòng)靜脈，間接血供為股動(dòng)靜脈[7]，血管位置恒定、有穩(wěn)定的組織灌注區(qū)域，大鼠股動(dòng)、靜脈內(nèi)徑約0.5mm左右，易于置管灌注操作。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠帶蒂SIEA皮瓣，簡(jiǎn)化了灌注操作流程，并提高術(shù)后皮瓣成活率。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中采用活體成像系統(tǒng)直接觀察術(shù)后皮瓣EGFP表達(dá)情況，使目的蛋白的檢測(cè)更佳直觀。共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果表明，腺病毒載體可以將外源基因EGFP轉(zhuǎn)染至SIEA皮瓣的血管內(nèi)膜、外膜以及血管外實(shí)質(zhì)組織（脂肪、毛囊、肉膜），并且表達(dá)基因產(chǎn)物。為進(jìn)一步深入研究經(jīng)動(dòng)脈灌注轉(zhuǎn)染復(fù)合組織瓣，建立了一套簡(jiǎn)便、可靠的動(dòng)物研究模型。

應(yīng)用復(fù)合組織瓣轉(zhuǎn)移修復(fù)創(chuàng)面是一種成熟的手術(shù)方式，以往在整形外科領(lǐng)域僅承擔(dān)創(chuàng)面修復(fù)重建的功能。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)動(dòng)脈灌注復(fù)合組織瓣的微血管床，使復(fù)合組織瓣產(chǎn)生目的蛋白，發(fā)揮兼具修復(fù)重建與治療的雙重功能。這項(xiàng)技術(shù)不僅可以應(yīng)用于皮瓣自身的治療，還可以對(duì)腫瘤切除后創(chuàng)面及慢性難愈性創(chuàng)面的進(jìn)行治療性修復(fù)[8]。未來，我們將為選擇高效、安全的載體及合適的目的基因做進(jìn)一步深入研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Dyer MR. Progress and potential for gene-based medicines[J]. Mol Ther, 2000, 1: 213-224.

[2]易成剛,郭樹忠. 基因治療在整形外科中的應(yīng)用[J]. 中國美容醫(yī)學(xué), 2003, 12(3): 328-332.

[3]Michaels J, Levine JP, Hazen A, et al. Biologic brachytherapy: Ex vivo transduction of microvascular beds for efficient, targeted gene therapy[J]. Plast Reconstr Surg, 2006,118: 54-65.

[4]Taub PJ, Marmur JD, Zhang WX . Effect of time on the viability of ischemic skin flaps treated with vascular endothelial growth factor (VEGF) cDNA[J]. J Reconstr Microsurg,1998,14:387-390.

[5]Taub PJ, Marmur JD, Zhang WX. Locally administered vascular endothelial growth factor cDNA increases survival of ischemic experimental skin flaps[J]. Plast Reconstr Surg,1998,102:2033-2039.

[6]潘華,郭樹忠,張旭東,等. 近交系大鼠腹部游離皮瓣移植模型的建立及意義[J]. 中國美容醫(yī)學(xué), 2007, 16(12): 1672-1675

[7]Petry JJ, Wortham KA. The anatomy of the epigastric flap in the experimental rat[J]. Plast Reconstr Surg,1984,74: 410.

[8]Marlese P, Cynthia H, Michaels J, et al. Using genetically modified microvascular free flaps to deliver local cancer immunotherapy with minimal systemic toxicity[J]. Plast Reconstr Surg, 2008,121: 1541-1553.

[收稿日期]2008-11-20[修回日期]2009-1-10

編輯/張惠娟