張?jiān)? 王 真 竹 傲 朱福興

摘要:研究了溴氰菊酯和辛硫磷亞致死劑量處理后,甜菜夜蛾羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、乙酰膽堿酯酶(AChE)的活性變化規(guī)律,結(jié)果表明:經(jīng)辛硫磷亞致死劑量5.20 mg/kg和溴氰菊酯亞致死劑量0.73 mg/kg處理后,甜菜夜蛾體內(nèi)CarE和GST均被不同程度的抑制,辛硫磷處理后24 h時(shí)與對(duì)照相比AChE活性下降了24.87%,而溴氰菊酯對(duì)AChE活性沒有明顯抑制作用。

關(guān)鍵詞:甜菜夜蛾;亞致死劑量;羧酸酯酶;谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶;乙酰膽堿酯酶

中圖分類號(hào):S433.5,Q965.9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:ADOI編碼:10.3969/j.issn.1006-6500.2009.05.012

Effect of Sublethal Doses of Deltamethrin and Phoxim on Enzyme Activity of Beet Armyworm

ZHANG Yuan-jian, WANG Zhen, ZHU Ao, ZHU Fu-xing

(College of Plant Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan, Hubei 430070, China)

Abstract:Effect of sublethal doses of deltamethrin and phoxim on activities of carboxylesterase,glutathione s-transferase and acetylcholinesterase of beet armyworm, Spodoptera exigua (Hübner) were measured. There was a significant decline in CarE and GST activities 24 to 72 hours after treated with sublethal concentration of phoxim and deltamethrin. As for AChE, the activity decreased by 24.87% when compared with the check 24 hours after treated with sublethal concentration of phoxim, while sublethal concentration of deltamethrin had no significant inhibition on AChE activity.

Key words: Spodoptera exigua (Hübner); sublethal concentration; carboxylesterase; glutathione s-transferase; acetylcholinesterase

甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hübner),屬鱗翅目夜蛾科灰翅夜蛾屬(曾歸貪夜蛾Laphygma),其別名貪夜蛾,是一種世界性雜食性害蟲,極易產(chǎn)生抗藥性,防治難度較大[1]。殺蟲劑亞致死劑量處理昆蟲后,除了對(duì)昆蟲的抗性、行為以及生長發(fā)育等產(chǎn)生影響外,還會(huì)對(duì)昆蟲體內(nèi)的重要靶標(biāo)酶如乙酰膽堿酯酶(AChE)、羧酸酯酶(CarE)以及谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)等產(chǎn)生一定的影響[2]。本試驗(yàn)通過研究溴氰菊酯和辛硫磷劑亞致死劑量對(duì)甜菜夜蛾體內(nèi)羧酸酯酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和乙酰膽堿酯酶活性的影響,為深入研究甜菜夜蛾的抗性以及科學(xué)合理用藥提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1供試?yán)ハx

供試甜菜夜蛾采自湖北,在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)人工飼養(yǎng)多代。在光周期L14:D10,溫度(27±1)℃,濕度70%的條件下飼養(yǎng),幼蟲用人工飼料飼養(yǎng)[3],所用容器為24孔盤和120孔盤,成蟲羽化后放置于罩有白色紗布的交配器中用5%的白糖水飼喂,白色紗布供成蟲產(chǎn)卵。

1.2供試藥劑及試劑

40%辛硫磷乳油(滄州中天化工有限責(zé)任公司生產(chǎn));2.5%溴氰菊酯乳油(拜耳作物科學(xué)中國有限公司生產(chǎn));碘化硫代乙酰膽堿(ATCh),5, 5-二硫-雙-2-硝基苯甲酸(DTNB),毒扁豆堿(Eserine),考馬斯亮藍(lán)G-250(Coomassie Brilliant G-250),Fluka公司生產(chǎn);1-氯-2, 4-二硝基苯(CDNB),α-乙酸萘酯(α-Naphthyl Acetate),固藍(lán)B鹽(Fast blue B Salt),醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司生產(chǎn);α-萘酚(1-Naphthol),上海化學(xué)試劑采購供應(yīng)五聯(lián)化工廠生產(chǎn);十二烷基硫酸鈉(SDS),天津市凱通化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn);還原型谷胱甘肽(L-Glutathione,GSH),武漢亞法生物技術(shù)公司分裝;牛血清白蛋白(BSA),武漢生命技術(shù)有限公司生產(chǎn);其它試劑為國內(nèi)分析純。

1.3儀器

分光光度計(jì)UV-1100,上海美譜達(dá)儀器有限公司生產(chǎn);電子天平SHIMADZU,日本株式會(huì)社生產(chǎn);CRG系列高速冷凍離心機(jī),HITACHI公司生產(chǎn)。

1.4酶活性測定

1.4.1試蟲處理取健康一致的同日齡(3齡)甜菜夜蛾幼蟲,分別用辛硫磷的LC20濃度為5.20 mg/kg和溴氰菊酯的LC20濃度為0.73 mg/kg作為亞致死劑量。測定采用浸葉法,取新鮮甘藍(lán)葉片,用清水洗凈并自然涼干后在供試藥劑中浸泡2 min,取出晾干備用,每個(gè)處理重復(fù)3次,以清水處理為對(duì)照,將晾干的葉片放入墊有濕濾紙的養(yǎng)蟲盒中,并接入試蟲,每盒15頭,24 h后檢查蟲體死亡情況并換為人工飼料飼養(yǎng),分別在0,24,48和72 h時(shí)取活蟲制備酶液,其中0 h為接觸藥劑之前的3齡幼蟲。

1.4.2酶源制備分別取經(jīng)過亞致死劑量處理后不同時(shí)間的試蟲(用藥前3齡幼蟲10頭、用藥后24 h 3齡幼蟲8頭,用藥后48 h 4齡幼蟲6頭),放入玻璃勻漿器中,加入0.04 mo1/L,pH 7.0的磷酸緩沖液(PBS)5 mL冰浴勻漿,勻漿液在4℃下,10 000 r/min離心10 min,取上清液作為酶源。

1.4.3羧酸酯酶活性測定取適量稀釋后的酶液1 mL,加入3×10-4 mol/L的α-乙酸萘酯(α-NA)底物1.0 mL和10-4 mol/L毒扁豆堿0.01 mL,混勻后于37 ℃恒溫水浴中反應(yīng)10 min,然后加入0.5 mL顯色液(1%固藍(lán)B鹽溶液∶5%十二烷基硫酸鈉溶液=2∶5,現(xiàn)用現(xiàn)配),搖勻后靜置15 min,于600 nm處比色測定,以磷酸緩沖液取代酶液作為對(duì)照[4,5]。以α-萘酚作標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求得酶促反應(yīng)生成的α-萘酚量,然后計(jì)算出羧酸酯酶的活性。

1.4.4谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性測定取2.78 mL 0.01 mol/L pH 7.0的磷酸緩沖液,0.1 mL 0.05 mol/L還原型谷胱甘肽(GSH),1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)丙酮液(0.05 mol/L)0.02 mL ,以及0.1 mL 酶液混合均勻后加入比色杯中,在340 nm處調(diào)零,每隔1 min記錄1次吸光度值,共記錄3次[6,7]。取第3分鐘時(shí)吸光度變化值,根據(jù)GST活力[μmol/(mg·min)]= (△OD×V)/(ε×L) / 酶液蛋白質(zhì)含量來計(jì)算酶活性。其中,△OD為每分鐘吸光度的變化值(OD340/min),V為酶促反應(yīng)體積(3 mL),ε為產(chǎn)物的消光系數(shù)[0.009 6 L/(μmol·cm)][8],L為比色杯的光程(1 cm)。

1.4.5乙酰膽堿酯酶活性測定反應(yīng)體系總體積0.2 mL ,反應(yīng)體系組成為:0.1 mL 酶液,0.1 mL 的0.75 mmol/L底物(碘化硫代乙酰膽堿),30℃下反應(yīng)15 min,加入1.8 mL DTNB-磷酸鹽-乙醇(稱取0.012 4 g DTNB加入120 mL 96%乙醇,80 mL 蒸餾水,用0.1 mol/L pH 7.6磷酸緩沖液定容至250 mL)。在412 nm處比色測定,以磷酸緩沖液取代酶液作為對(duì)照[9]。根據(jù)乙酰膽堿酯酶活力[nmol/(mg·min)]=(△OD×V)/(ε×L)/酶液蛋白質(zhì)含量來計(jì)算酶活性。其中,△OD為每分鐘吸光度的變化值(OD412/min),V為酶促反應(yīng)體積(2 mL),ε為產(chǎn)物的消光系數(shù)[1.36×104 L/(mol·cm)][10],L為比色杯的光程(1 cm)。

1.4.6 蛋白質(zhì)含量測定考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量[11],以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

2結(jié)果與分析

經(jīng)辛硫磷亞致死劑量LC20(5.20 mg/kg)和溴氰菊酯亞致死劑量LC20(0.73 mg/kg)處理后,甜菜夜蛾幼蟲的死亡率分別是15.87%和17.46%。

2.1殺蟲劑亞致死劑量對(duì)甜菜夜蛾幼蟲羧酸酯酶活性的影響

從圖1可以看出,經(jīng)辛硫磷亞致死劑量LC20處理后甜菜夜蛾幼蟲羧酸酯酶活性在24 h時(shí)明顯降低,與對(duì)照相比降低了77.58%,隨后雖然略有回升,但與對(duì)照相比仍然較低。經(jīng)溴氰菊酯亞致死劑量LC20處理后,甜菜夜蛾幼蟲羧酸酯酶活性在48 h內(nèi)持續(xù)下降,24 h時(shí)與對(duì)照相比降低了35.73%,在72 h時(shí)略有上升,但酶活性仍低于對(duì)照,經(jīng)差異顯著性分析,兩種藥劑處理后24~72 h之間羧酸酯酶活性均低于對(duì)照,且差異顯著。另外,辛硫磷處理后羧酸酯酶活性下降的幅度大于溴氰菊酯,且差異顯著。

試驗(yàn)中,隨著時(shí)間的變化,對(duì)照的3種酶活性都出現(xiàn)了不同程度的下降,尤其是在24~48 h時(shí)下降幅度最大,通過試驗(yàn)中的觀察,48 h時(shí)的甜菜夜蛾幼蟲已經(jīng)從3齡進(jìn)入4齡階段,這與彭梅等[12]的研究結(jié)果——甜菜夜蛾在低齡幼蟲時(shí)體內(nèi)的靶標(biāo)酶和代謝酶活性高于高齡幼蟲是一致的。

2.2殺蟲劑亞致死劑量對(duì)甜菜夜蛾幼蟲乙酰膽堿酯酶活性的影響

從圖2中的結(jié)果可以看出,經(jīng)辛硫磷亞致死劑量LC20處理后甜菜夜蛾幼蟲乙酰膽堿酯酶活性在72 h內(nèi)持續(xù)降低,始終低于對(duì)照,24 h時(shí)比對(duì)照下降了24.87%,差異顯著;48 h時(shí)對(duì)照的酶活性下降幅度略大于辛硫磷處理,二者間差異不顯著;到72 h時(shí)差異又達(dá)顯著水平,這種動(dòng)態(tài)變化說明,辛硫磷處理后甜菜夜蛾體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活性處于動(dòng)態(tài)變化中。經(jīng)溴氰菊酯亞致死劑量LC20處理后甜菜夜蛾幼蟲乙酰膽堿酯酶活性在24 h時(shí)與對(duì)照相差不大,之后的酶活性略低于對(duì)照,但差異不顯著。可見,辛硫磷對(duì)甜菜夜蛾幼蟲體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶具有顯著的抑制作用,而溴氰菊酯沒有明顯的抑制作用。

2.3殺蟲劑亞致死劑量對(duì)甜菜夜蛾幼蟲谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性的影響

由圖3可以看出,經(jīng)辛硫磷亞致死劑量LC20處理后,甜菜夜蛾幼蟲谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性在72 h內(nèi)持續(xù)下降,均低于對(duì)照,24 h時(shí)比對(duì)照降低了12.21%,經(jīng)溴氰菊酯亞致死劑量LC20處理后,甜菜夜蛾幼蟲谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性在24 h時(shí)降到最低,比對(duì)照降低了30.46%,之后出現(xiàn)上升趨勢,但是仍低于對(duì)照。經(jīng)差異顯著性分析,兩種藥劑處理與對(duì)照間均達(dá)顯著水平。辛硫磷處理對(duì)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性的影響始終大于溴氰菊酯,其中,24 h和72 h時(shí)差異顯著。

3小結(jié)與討論

乙酰膽堿酯酶是昆蟲體內(nèi)重要的生化標(biāo)記物,可以利用其活性變化監(jiān)測殺蟲劑對(duì)昆蟲的亞致死效應(yīng),目前在亞致死狀態(tài)下殺蟲劑對(duì)昆蟲體內(nèi)AChE的時(shí)間效用研究較少。本研究結(jié)果表明,辛硫磷亞致死劑量對(duì)甜菜夜蛾AChE的活力存在抑制作用,這與亞致死劑量的辛硫磷對(duì)棉鈴蟲AChE活性沒有誘導(dǎo)增加作用,反而使其活性下降一致[13]。而溴氰菊酯雖然在48 h后也表現(xiàn)出了一定的抑制作用,但抑制作用并不顯著,這可能與乙酰膽堿酯酶不是擬除蟲菊酯類的作用靶標(biāo)有關(guān),試驗(yàn)中表現(xiàn)出的抑制作用是由什么原因?qū)е氯孕柽M(jìn)一步的研究。

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶是催化親電子物質(zhì)與內(nèi)源還原型谷胱甘肽(GSH)結(jié)合的一類酶,在昆蟲對(duì)殺蟲劑的解毒中起著重要作用。本研究結(jié)果顯示,亞致死濃度的辛硫磷和溴氰菊酯對(duì)甜菜夜蛾谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶均有抑制作用,這與高希武等[14]用亞致死劑量的滅多威處理后3齡棉鈴蟲的 GST活性下降是一致的,但是用亞致死劑量的對(duì)硫磷處理 3齡棉鈴蟲幼蟲24 h后,發(fā)現(xiàn)GST活性與對(duì)照組沒有顯著差異。Rumpf等[15]用氯氰菊酯亞致死劑量處理褐蛉幼蟲后,發(fā)現(xiàn)其GST活性明顯增加,而用苯氧威亞致死劑量處理后GST活性卻明顯降低。這說明亞致死劑量的不同殺蟲劑對(duì)不同昆蟲的GST活性的影響可能存在差異,有關(guān)不同殺蟲劑對(duì)不同昆蟲的GST活性影響的生物化學(xué)和分子生物學(xué)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

兩種藥劑亞致死劑量處理對(duì)甜菜夜蛾CarE有一定的抑制作用,這與高希武等[14]用對(duì)硫磷、馬拉硫磷、倍硫磷、滅多威和溴氰菊酯等亞致死劑量處理棉鈴蟲48 h后其CarE比活力明顯降低的研究結(jié)果基本一致。唐培安等[16]研究發(fā)現(xiàn)甲酸乙酯對(duì)米象成蟲CarE的影響表現(xiàn)為先抑制后誘導(dǎo)的作用,這說明亞致死劑量的不同殺蟲劑對(duì)不同昆蟲的CarE活性的影響可能存在差異。李騰武等[17]的研究也表明,不同藥劑對(duì)同種昆蟲羧酸酯酶的抑制作用不同,同一種藥劑對(duì)不同種群的抑制作用也不相同,關(guān)于藥劑對(duì)羧酸酯酶具體影響的機(jī)理需要進(jìn)一步的研究。

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