摘要：白菜類作物是我國乃至世界性的大眾蔬菜，利用農桿菌介導技術將目的基因轉入蔬菜中，從而選育具有特殊性狀的新品種。文章綜述了根癌農桿菌介導的白菜類作物高頻再生轉化體系構建的影響因素，簡要介紹了轉化植株的分子檢測及遺傳行為，在此基礎上分析了目前遺傳轉化技術在白菜類作物改良上存在的問題及廣闊的應用前景。

關鍵詞：白菜類作物；根癌農桿菌；轉基因；分子檢測；遺傳轉化

白菜類作物屬于十字花科(Crociferae)蕓薹屬蕓薹種(Brosslca campestris L.)中的栽培變種群。原產我國，目前廣泛種植于中國、日本、韓國、朝鮮等東亞及東南亞國家。大白菜(Brassica ssp.pekinensis)、小白菜(Brassica ssp.chinensis)、白菜型油菜(Brassica ssp.oleifera)均屬于該種。隨著組織培養(yǎng)和DNA重組技術的建立和不斷完善，轉基因技術已經成為改良農藝性狀。解決農業(yè)生產難題的重要手段。由于農桿菌介導法成本低、簡便易行、轉化效率較高，因此成為白菜類作物遺傳轉化中最常用的方法。

農桿菌介導的甘藍、油菜、芥菜、蕪菁等蕓薹屬植物的遺傳轉化已經獲得了很大的成功。但白菜類作物的遺傳轉化僅在近年才有報道，其中主要集中在大白菜的遺傳轉化上，有關白菜和菜心的遺傳轉化成功的報道很少。究其原因是由于白菜具有AA基因組，與蕓薹屬的其他具有BB和CC基因組的植物相比，其不定芽和植株再生比較難，此外，不同的抑菌劑和轉化菌株對外植體的分化也有一定的影響。因此，研究白菜類蔬菜的遺傳轉化體系，對基因工程技術在白菜類作物遺傳育種領域中的廣泛應用具有重要的理論和實踐意義。筆者就高頻再生體系和遺傳轉化體系這兩方面進行概述。

1 高頻再生體系的建立

建立高頻再生體系是植物遺傳轉化的前提。組織培養(yǎng)包括原生質體培養(yǎng)再生體系已在蕓薹屬的很多種中建立。相比之下，白菜類作物轉化難度較大。近年來，研究人員通過調整培養(yǎng)基中激素的種類和濃度，添加一定濃度的AgNO₃，改變瓊脂濃度條件等，已相繼建立了離體植株再生體系。

1.1 植物基因型

不同基因型的植株離體再生能力的差異較大。Zhang等對123個大白菜品種進行對比試驗，有115個品種產生了不定芽，再生頻率從0到95％不等。他認為植株再生能力與品種的起源、成熟期的長短無關，與體細胞器官發(fā)生能力及小孢子胚胎發(fā)生能力無關，而只與其基因型有關。曹家樹研究了上海青、矮抗青、杭州油冬兒等8個品種，發(fā)現青梗類白菜品種的植株再生頻率明顯高于白梗類品種，認為青梗類品種更適宜于離體培養(yǎng)的植株再生。因此，選擇合適的基因型對試驗成功起著至關重要的作用。

1.2 外植體

用于轉化的外植體組織通常有下胚軸、子葉柄、子葉、莖段等，較常用的為下胚軸、子葉、子葉柄。不同外植體組織的再生頻率不同，王凌健等以青菜子葉和下胚軸為外植體誘導分化，子葉的分化頻率達56.3％，而下胚軸為37％左右。杜虹等以大白菜的子葉和下胚軸為外植體誘導分化，發(fā)現以子葉為外植體誘導再生芽比下胚軸要好。

1.3 植物激素

組織培養(yǎng)中激素的配比決定了外植體在培養(yǎng)基上生長的形態(tài)。一般來說，生長素與細胞分裂素的比值低，易誘導芽的發(fā)生：相反則易誘導根的發(fā)生；比值處于中間，容易產生愈傷組織，多年來，學者們都摸索出了適合自己試驗條件的激素濃度。激素以BA、NAA組合為多，也有用BAP、NAA組合的。白菜類作物BA(BAP)的使用濃度一般為2～5 mg/L，NAA一般為0.5～1mg/L。

1.4 AgNO₃對再生體系的影響

組織培養(yǎng)過程中，加入AgNO₃可明顯提高轉化效率。培養(yǎng)基中添加AgNO₃后，Ag+競爭性結合位于細胞間膜的乙烯受體部位而抑制乙烯活性，并且干擾乙烯信號傳遞途徑，從而促進器官發(fā)生和體細胞胚胎發(fā)生。杜虹等的研究表明，大白菜的芽再生率從未添加AgNO₃的28.2％，添加1.2×10^-5mol/L后提高到71.7％。也有的學者認為AgNO₃與ABA配合使用更能促進白菜不定芽的發(fā)生，王火旭認為AgNO₃與ABA具有協同增效作用。其中AgNO₃是關鍵因子，ABA有促進作用，能改善不定芽的質量，減少玻璃芽的產生。但對某些基因型品種，添加AgNO₃，并沒有使其誘導出不定芽，而且隨著AgNO₃含量的提高，芽分化率有所降低，這可能是由于Ag+與培養(yǎng)基中的陰離子發(fā)生反應，打破了離子平衡，改變了培養(yǎng)基的pH值。而且Ag+離子是重金屬，對植物體有毒害作用，因此培養(yǎng)基中AgNO₃的含量不能過高。

1.5 瓊脂濃度對再生體系的影響

Zhang等用不同濃度的瓊脂培養(yǎng)基處理外植體，發(fā)現1.2％或1.6％的瓊脂培養(yǎng)基比0.8％的培養(yǎng)基芽再生率高2～3倍。他還發(fā)現隨著瓊脂濃度的升高，培養(yǎng)基中的乙烯含量逐漸降低。這可能是高濃度的瓊脂改變了培養(yǎng)基中水分的存在狀態(tài)，同時培養(yǎng)基中濕度下降，改變了外植體再生的小氣候而使其再生頻率提高。

2 遺傳轉化與植株再生

農桿菌介導技術是迄今植物基因工程中應用最多、最理想、也是最簡單的方法，已獲得的轉基因植物中80％來自農桿菌介導轉化。用于植物遺傳轉化的農桿菌有2種：根癌農桿菌和發(fā)根農桿菌。在白菜研究中，多數學者采用根癌農桿菌進行轉化。

2.1 不依賴于植物細胞或組織培養(yǎng)的轉化系統(tǒng)

曹鳴慶等采用原位滲入轉化方法應用于49菜心，獲得了遺傳上穩(wěn)定的轉基因植株，使得小白菜成為第1例成功應用該技術的有經濟價值的植物，但這一方法在操作過程中有很多缺陷，應用起來有較大難度。戴大鵬在此基礎上選用小白菜花序切口及花序進行轉化，簡化了操作過程并成功將目的基因整合入植株中，為白菜類作物轉基因技術的發(fā)展提供了新的技術途徑，但該方法的轉化效率較低，有待進一步的研究。

2.2 建立在細胞或組織培養(yǎng)基礎上的遺傳轉化

依賴細胞(或組織培養(yǎng))的遺傳轉化是由植物細胞和農桿菌共培養(yǎng)一段時間，轉化體在古適宜濃度的抗生素、抑菌劑的篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，發(fā)生了T-DNA轉移的復雜生物學過程。影響農桿菌轉化的因素很多，主要有以下幾方面：

2.2.1 農桿菌菌株對轉化和再生的影響農桿菌依其產生的冠癭堿不同，可分為章魚堿型(octopine)、胭脂堿型(nopaline)、農桿堿型(agropine)和琥珀型(succinamopine)。Kuvshinov等用3個不同的菌株(C58C1，EHA105，LB4404)侵染白菜型油菜，結果發(fā)現LBA4404的轉化效率較好，大約是C58C1、EHA105轉化效率的2倍，余小林等用EHA105和LBA4404感染白菜和菜心的子葉柄一子葉外植體，采用統(tǒng)計分析方法對產生的不定芽進行結果分析得到白菜類作物遺傳轉化時，LBA4404感染效果較好；而范正琪用EHA105和LBA4404侵染青菜，結果顯示EHA105轉化時，gus瞬時表達頻率(52％)高于LBA4404(47.1％)。試驗結論的一致可能與供試材料基因型有關。

2.2.2 Vir基因 由于根癌農桿菌的感染能力主要受Ti質粒的Vir基因調節(jié)，因此，如何誘導Vir基因的高效表達一直是學者們研究的重點m問。Vemader等認為在酸性條件和加入酚類物質(如乙酰丁香酮)的條件下，Vir的活性得到提高。白菜類作物乙酰丁香酮(As)的使用濃度為20-200 umol/L，但濃度與轉化效率的關系目前尚未見報道。介導轉化過程中，As的使用有3種情況：(1)在農桿菌液體培養(yǎng)時加入As；(2)在農桿菌與外植體共培養(yǎng)時加入As；(3)在農桿菌培養(yǎng)及共培養(yǎng)時均加入As，誘導活化Vir基因。

張鳳蘭在共培養(yǎng)基中加入As，pH值5.2條件下通過對3個大白菜品種進行轉化試驗，得到降低共培養(yǎng)基的pH值，加入As可以提高根癌農桿菌感染白菜外植體的頻率。而楊廣東等在共培養(yǎng)基中加入As對4個大白菜品種進行農桿菌侵染時，發(fā)現As對轉化頻率有一定的促進作用，但差異并不顯著；相反在侵染前附加時轉化頻率反而降低，原因可能是與品種基因型有關。

決定農桿菌Vir基因誘導的關鍵時期為共培養(yǎng)時段，注意共培養(yǎng)時的幾個關鍵則可以使Vir基因得以高效表達，進而為后期的轉化打下好的基礎：(1)避免農桿菌在酵母提取物存在的環(huán)境下過度生長，通常把農桿菌培養(yǎng)液離心，用MS液體培養(yǎng)基重懸農桿菌沉淀；(2)共培養(yǎng)基中要含有較高的糖濃度，蔗糖含量應在30％以上。也可同時在培養(yǎng)基中加入適量的葡萄糖或椰子汁；(3)培養(yǎng)基pH值介于5.0～5.6；(4)共培養(yǎng)時的溫度低于28℃，一般置25℃暗處共培養(yǎng)；(5)共培養(yǎng)時間通常以2～3d為好，目前只有范正琪通過對青菜帶柄子葉進行轉化發(fā)現共培養(yǎng)5 d轉化的頻率較高。

2.2.3 植物基因型及外植體種類 植物基因型對遺傳轉化的影響在擬南芥等模式植物上均有報道，同樣基因型對白菜類作物的遺傳轉化也存在影響。范正琪選取5個青菜品種進行農桿菌侵染，得到高樺白菜轉化頻率最高。Muknopadhyay，Takasaki及Lim等分別從白菜型油菜、擬南芥及大白菜的下胚軸得到轉化體。Jun，張鳳蘭和余小林等以子葉－子葉柄為轉化受體，在大白菜上得到了轉化體。劉凡等以小孢子培養(yǎng)產生的胚為轉化受體，在大白菜上得到了轉化株，為再生難的白菜類基因型轉化提供了一條新途徑。

2.2.4 抗生素 在農桿菌介導的轉化過程中，為了抑制農桿菌的生長，需要在共培養(yǎng)以后加入抗生素?？股匾志暮脡闹苯佑绊戅D化效率。白菜類作物常用的抗生素有氨芐青霉素(Amoicillin)、羧芐青霉索(Carbenillln)、頭孢霉素(Cefo－taxime)、淡紫青霉素(LilaciHin)等。在有效抑菌濃度范圍內氨芐青霉素質量濃度在500mg/L以下，對不定芽的再生有輕微的抑制作用。而羧芐青霉素則有促進作用(250～500 mg/L)，頭孢霉素對不定芽的再生有明顯的抑制作用，易引起外植體傷口褐化死亡，這也許與白菜類蔬菜對頭孢霉素過于敏感有關。張鳳蘭認為淡紫青霉素較好，他通過研究不同濃度的淡紫青霉素對白菜子葉不定芽的影響，發(fā)現不定芽再生幾乎不受淡紫青霉素的影響。由于淡紫青霉素在國內較難買到，關于它的應用報道較少，因而羧芐青霉素暫時是首選的抗生素。

2.2.5 篩選劑對轉化的影響 共培養(yǎng)后，組織中存在著轉化細胞和非轉化的細胞，而前者所占的比例較低，須施加選擇壓，才能促進轉化細胞的分裂和生長，抑制非轉化細胞，進而選出轉化細胞，獲得轉基因植株。白菜類作物中使用的篩選標記有：卡那霉素抗性和潮霉素抗性。選擇標記的種類、選擇濃度及選擇時間是影響轉化效率的重要因素。Takasaki等用卡那霉素選擇小白菜轉化株，得到了大量的逃逸體。而用低濃度的潮霉素沒有逃逸體。然而用卡那霉素選擇的轉化頻率比用潮霉素要高，可能是因為潮霉素選擇壓力大，對一些外源基因表達水平低的芽也產生了抑制生長作用。KuvshinovIml和范正琪分別在白菜類油菜和青菜中得到了類似的結論?？敲顾爻Ｓ觅|量濃度以5～10mg/L好，潮霉素質量濃度要低于5mg/L。

總的說來，農桿菌介導白菜類作物遺傳轉化過程可劃分為預培養(yǎng)→共培養(yǎng)→恢復培養(yǎng)→篩選分化培養(yǎng)→生根培養(yǎng)階段。以下胚軸為外植體時進行預培養(yǎng)多可以提高植株的再生頻率，預培養(yǎng)2～3d為宜，采用其他外植體類型時，預培養(yǎng)過程往往對轉化率的提高作用不大，張鳳蘭通過以子葉一子葉柄為外植體進行白菜的遺傳轉化試驗，發(fā)現可以在根癌農桿菌感染前不用預培養(yǎng)：根癌農桿菌侵染時菌液濃度、侵染時間及培養(yǎng)時間對轉化有很重要的影響：張鳳蘭對大白菜進行轉化時用OD₆₀₀ 0.8的菌液侵染外植體10～15min，共培養(yǎng)3 d；王火旭用菌液OD₆₀₀ 0.3～0.5，浸染大白菜2～10min，共培養(yǎng)2～3 d；范正琪用菌液OD₆₀₀ 0.5左右侵染青菜帶柄子葉15min，共培養(yǎng)5 d。上述試驗均獲得了轉化苗，但條件卻不能普遍應用。此外有些學者認為在共培養(yǎng)基中加入乙酰丁香酮(As)可以提高轉化效率，而有些研究者發(fā)現加入As對轉化效率的影響不大。藍海燕則認為加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)可以克服組織培養(yǎng)中的褐化現象。外植體共培養(yǎng)后，轉到選擇培養(yǎng)基前進行恢復是必要的，但恢復期越長，產生的逃逸體就會越多。由于白菜類作物比較脆弱，選擇壓的濃度應以溫和為好，從而易獲得轉化苗。進行篩選分化時，要注意乙烯對芽分化的影響：適宜的AgNO₃濃度可以解除乙烯對芽分化的影響。Mu-knopadhyay在白菜型油菜的轉化中，發(fā)現較高的AgNO₃濃度(70-90 nmol)是在選擇條件下獲得轉化體的必要條件。然而Kuvshinov認為，過高的AgNO₃質量濃度(超過15mg/L，約90nmol)不利于轉化，以5mg/L為好；張風蘭在大白菜的轉化中，發(fā)現較高的瓊脂濃度(1.6％)有利于大白菜不定芽分化和根的生成。

3 轉基因植株的分子檢測及轉化基因的遺傳分析

證明外源基因在植物染色體上整合最可靠的方法是分子雜交：DNA水平上可以通過PCR及Southern雜交來確定外源基因的導人及整合；RNA水平上可以通過Northern雜交及RT-PCR檢測外源基因是否轉錄：蛋白質水平上可以通過Western雜交測定外源基因的表達。Kuvshinov采用組織一葡萄糖醛酸酶染色和Southern雜交進行檢測，結果獲得的轉化株僅為4％～9％。這種行為的發(fā)生是因為農桿菌介導的白菜類作物轉基因植株中，多數為單拷貝植株，它們的遺傳傳遞行為符合孟德爾的遺傳規(guī)律：單拷貝轉基因植株自交后代的遺傳分離比一般為3:1，而有時又因插入的T-DNA出現甲基化等遺傳變異而失活，導致后代中并非所有插入的T-DNA都能得以表達。

4 存在的問題和展望

多年來學者們通過努力成功摸索出了白菜類作物不同基因型品種的遺傳轉化體系，但仍存在著很多的問題：(1)摸索出來的各項參數還未達到優(yōu)化，成功的例子差異較大，有些參數的條件不能普遍應用；(2)雖然現在有些學者找到了耨的技術，彌補了以前試驗中的一些不足。但轉化的效率較低，還需要進一步深入的研究；(3)獲得的轉基因植株所占比例過小，與之相對的試驗所需人力費用卻較大，需要研制出更經濟的轉化體系；(4)轉化植株后代遺傳穩(wěn)定性的問題還沒有得到真正的解決；(5)轉基因白菜的食品安全性問題沒有得到更好的解決。因此白菜類作物的高效遺傳轉化體系亟待完善。只有研究者們不斷努力，加強合作，才能使基因工程技術在白菜類蔬菜作物生產中得到廣泛應用。更好地為人們服務。