李永剛　宋興舜　趙雪瑩　馬鳳鳴

摘要：通過(guò)對(duì)峙培養(yǎng)，測(cè)定出枯草芽孢桿菌L1的抑菌譜較寬，特別是對(duì)水稻紋枯病菌、大豆菌核病菌、禾谷鐮孢菌、辣椒灰霉病菌、玉米小斑病菌抑菌效果明顯；枯草芽孢桿菌L1不同發(fā)酵時(shí)間經(jīng)濕熱滅菌處理后，5 d發(fā)酵液中抑菌活性物質(zhì)含量最高，對(duì)水稻紋枯病菌菌絲生長(zhǎng)抑制率達(dá)83.23％，發(fā)酵液隨時(shí)間延長(zhǎng)抑菌效果不再增加；枯草芽孢桿菌L1新疆棉花立枯病根際拮抗放線菌的篩選1抑菌活性物質(zhì)對(duì)溫度不敏感；枯草芽孢桿菌L1發(fā)酵液用硫酸銨梯度沉淀法提取粗蛋白在硫酸銨飽和度達(dá)60％～70％(不含60％)沉淀的活性物質(zhì)抑菌效果最好，對(duì)水稻紋枯病菌平均抑菌半徑達(dá)1.15；枯草芽孢桿菌L1對(duì)玉米、大豆、小麥、番茄、菜豆、黃瓜、水稻無(wú)致病性，而且還有保鮮和促生作用。

關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌；抑菌物質(zhì)；粗蛋白；致病性

中圖分類號(hào)：S 482．292

水稻紋枯病(rice sheath blight)是水稻上三大重要病害之一，從全國(guó)范圍看，部分省、地區(qū)稻紋枯病超過(guò)稻瘟病的危害，居水稻三大病害之首。由于當(dāng)前推廣的水稻品種缺乏高抗紋枯病基因，隨著矮稈品種和雜交水稻的大面積推廣及水田管理等措施的影響，水稻紋枯病發(fā)生面積正逐年擴(kuò)大，導(dǎo)致我國(guó)水稻產(chǎn)量年損失在10％以上。長(zhǎng)期以來(lái)，我國(guó)大多數(shù)稻區(qū)都使用井岡霉素防治，雖然井岡霉素能夠有效地控制水稻紋枯病，但是大面積、長(zhǎng)期使用井岡霉素，極易導(dǎo)致病原菌Rhizoctonia solani產(chǎn)生抗藥性，這個(gè)問(wèn)題已引起國(guó)內(nèi)外有關(guān)專家的高度關(guān)注。戊菌隆等防治紋枯病的化學(xué)農(nóng)藥又產(chǎn)生毒性及殘留問(wèn)題，且污染環(huán)境。所以，探索新的防治途徑十分必要。

在研究開(kāi)發(fā)的各種生防菌中，利用生防細(xì)菌來(lái)防治植物病害成為國(guó)內(nèi)外在生物防治研究中的一個(gè)熱點(diǎn)。大量的研究表明，生防細(xì)菌不僅在其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中產(chǎn)生多種拮抗性或競(jìng)爭(zhēng)性的代謝產(chǎn)物，通過(guò)直接或間接作用，達(dá)到阻礙或殺死病原菌的效果，而且這些細(xì)菌多是從植物的根圍和葉圍等處分離得到的，對(duì)植物具有較好的親和性，接種后易于在植物上定殖，生防效果持久穩(wěn)定。

芽孢桿菌(Bacillus spp.)是一類受到廣泛重視的拮抗細(xì)菌，其顯著特點(diǎn)是芽孢對(duì)干燥、熱、紫外線及有機(jī)溶劑的抗性。美國(guó)迄今已有4株枯草芽孢桿菌(B.subtilis)生防菌株獲得環(huán)保局(EPA)商品化或有限商品化生產(chǎn)應(yīng)用許可，它們是GB03、MBI600、QST713和B.subtilis var.amyloliqudefa-ciens FZB24；在國(guó)內(nèi)，1998年陳志誼應(yīng)用Bacillussubtilis B916防治水稻紋枯病面積達(dá)2 000 hm²，防治效果達(dá)50.0％～81.9％，說(shuō)明用Bacillus來(lái)開(kāi)發(fā)生防制劑的巨大優(yōu)勢(shì)。

本課題組從水稻根際中篩選到1株對(duì)水稻紋枯病菌具有很好拮抗效果的枯草芽孢桿菌L1，圍繞該菌的特性，進(jìn)行了相關(guān)研究。

1材料與方法

1．1枯草芽孢桿菌L1抑菌譜的測(cè)定

1．1．1供試生防菌株

枯草芽孢桿菌L1由本課題組自水稻根際土中分離、鑒定并保存。

1．1．2供試病原菌

供試菌株為桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)、水稻紋枯病菌[Rhizoctonia solani(rice)]、黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、大豆菌核病菌(Sclerotinia scle-rotiorum)、禾谷鐮孢菌(Fusarium graminearum)、辣椒灰霉病菌(Botrytis cinerea)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)和小麥紋枯病菌(Rhizoctonia cerealis)，由本實(shí)驗(yàn)室自行分離并保存，其中水稻紋枯病菌為指示菌株。

1．1．3培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)細(xì)菌采用NA(牛肉浸膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、瓊脂20 g、水1 000 mL、pH7.0)，液體培養(yǎng)采用KB(蛋白胨20.0 g、K₂HPO₄·3H₂O2.5 g、MgSO₄·7H₂O15.0 g、甘油10 mL、水1 000 mL、pH7.0)，拮抗作用測(cè)定用PDA(馬鈴薯200 g、瓊脂20 g、葡萄糖20 g、水1 000 mL)。

1．1．4試驗(yàn)方法

對(duì)供試的9種植物病原菌進(jìn)行拮抗作用的測(cè)定，枯草芽孢桿菌L1在NA培養(yǎng)基上28℃活化48 h后畫(huà)線接種在距PDA平板中心3 cm處，然后在此PDA平板的中央接種經(jīng)過(guò)擴(kuò)繁的水稻紋枯病菌菌碟(d=0.7 cm)，每個(gè)處理3次重復(fù)，放入恒溫箱中26℃培養(yǎng)96 h后測(cè)量植物病原菌菌絲生長(zhǎng)的最長(zhǎng)半徑與最短半徑，計(jì)算其比值。

1．2不同時(shí)間處理發(fā)酵液對(duì)水稻紋枯病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

生防細(xì)菌在定量100 mL KB液體培養(yǎng)基中28℃170 r／min振蕩培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7、10 d后，濕熱滅菌后取濾液加入定量的PDA培養(yǎng)基中使用濃度達(dá)到2％，充分混勻，倒入15 mL于滅菌的培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基冷卻后在平板中央接種0.7 cm的水稻紋枯病菌菌碟，以無(wú)菌水處理為空白對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)，26℃培養(yǎng)48 h后測(cè)定水稻紋枯病菌菌落直徑，計(jì)算抑菌率。

1．3不同溫度處理發(fā)酵液對(duì)水稻紋枯病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

將枯草芽孢桿菌L1在定量100mL KB液體培養(yǎng)基中(裝液量100 mL／300 mL三角瓶)28℃170 r／min振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h的菌液經(jīng)細(xì)菌濾器過(guò)濾后，經(jīng)過(guò)20℃、-20℃處理24 h，121℃處理20 min后，采用菌絲生長(zhǎng)速率法按3％的濃度測(cè)定其抑菌率，方法同1.2，加無(wú)菌水處理為空白對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)，26℃培養(yǎng)48 h后測(cè)定水稻紋枯病菌菌落直徑，計(jì)算抑菌率。

1．4抗菌粗蛋白質(zhì)的提取及活性測(cè)定

1．4．1抗菌粗蛋白質(zhì)的提取

參照邵敏蛋白提取方法略有改進(jìn)，將枯草芽孢桿菌L1接種于KB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜作為種子液，按1％接種量轉(zhuǎn)接于KB液體培養(yǎng)基中(裝液量100 mL／300 mL三角瓶)，28℃170 r／min培養(yǎng)48 h；發(fā)酵液經(jīng)濾紙過(guò)濾后，再通過(guò)細(xì)菌濾器除去菌體，收集濾液；抗菌粗蛋白質(zhì)采用(NH₄)₂SO₄分級(jí)沉淀法提取，7個(gè)硫酸銨梯度分別為：0～30％(含30％)、30％～40％(不含30％)、40％～50％(不含40％)、50％～60％(不含50％)、60％～70％(不含60％)、70％～80％(不含70％)、80％～100％(不

含80％)沉淀蛋白；4℃8 000 r／min離心20 min收集沉淀，溶于適量10 mmol／L的磷酸鈉鹽緩沖液(PBS，pH8.0)中；將蛋白溶液裝入處理好的透析袋(截留分子量12 000 D)中，4℃下用同緩沖液透析脫鹽。離心棄不溶性沉淀，上清液即為抗菌粗蛋白，用于抑菌活性檢測(cè)。

1．4．2抗菌粗蛋白質(zhì)對(duì)水稻紋枯病菌抑菌作用的測(cè)定

準(zhǔn)備好PDA平板，在距離PDA平板中央3 cm處用內(nèi)徑為0.7 cm的打孔器在對(duì)稱的方向上打2個(gè)孔，取0. 03 mL上述分級(jí)提取的抑菌粗蛋白注入每個(gè)孔中，然后在此PDA平板中央接種直徑為0.7cm水稻紋枯病菌菌碟，以無(wú)菌水為對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，26℃培養(yǎng)72 h后測(cè)量抑菌的半徑，分析比較差異顯著性。

1．5枯草芽孢桿菌L1對(duì)部分植物種子和果實(shí)致病性的測(cè)定

將枯草芽孢桿菌L1接種到KB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h后稀釋1倍備用。

玉米、小麥、水稻、大豆種子100粒采用枯草芽孢桿菌L1培養(yǎng)液浸泡1 h，取出晾干后催芽；而番茄和菜豆采用整個(gè)果實(shí)，黃瓜切成厚度為2 cm的圓片測(cè)定，浸泡1 h，取出晾干，然后放入封口袋中保濕，無(wú)菌水處理為對(duì)照，26℃保存4 d，觀察形態(tài)變化。

2結(jié)果與分析

2．1枯草芽孢桿菌L1抑菌譜的測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法，測(cè)定枯草芽孢桿菌L1對(duì)9種植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。

從表1可以看出，枯草芽孢桿菌L1對(duì)這9種植物病原菌都有一定的拮抗作用，其中對(duì)水稻紋枯病菌、大豆菌核病菌、禾谷鐮孢菌、辣椒灰霉病菌、玉米小斑病菌抑菌效果較好，拮抗最長(zhǎng)半徑(cm)與最短半徑(cm)3次平均值分別為2.17、2.90、2.27、2.03、2.20。

2．2不同培養(yǎng)時(shí)間發(fā)酵液對(duì)水稻紋枯病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

對(duì)枯草芽孢桿菌L1進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定該菌株分泌抗菌次生代謝產(chǎn)物達(dá)到平衡的時(shí)間，對(duì)培養(yǎng)菌株L1不同時(shí)間取樣，進(jìn)行濕熱滅菌，采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定其對(duì)水稻紋枯病菌抑菌效果，加無(wú)菌水作為對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)表2。

從表2可以看出，枯草芽孢桿菌L1不同培養(yǎng)時(shí)間的發(fā)酵液經(jīng)滅菌處理后，對(duì)水稻紋枯病菌菌絲抑制率存在差異，培養(yǎng)5 d與6、7、10 d的發(fā)酵液抑制率差異不顯著，而與4 d之前的發(fā)酵液存在顯著差異，說(shuō)明培養(yǎng)5 d時(shí)發(fā)酵液中抑菌活性物質(zhì)含量達(dá)最高，達(dá)83.23％，隨時(shí)間延長(zhǎng)抑菌效果不再增加。

2．3不同溫度處理發(fā)酵液對(duì)水稻紋枯病菌菌絲的影響

測(cè)定枯草芽孢桿菌L1起抑菌作用的活性物質(zhì)受溫度影響，將培養(yǎng)好的發(fā)酵液經(jīng)細(xì)菌濾器過(guò)濾后，20℃、-20℃處理24 h，121℃處理20 min后，無(wú)菌水為對(duì)照，測(cè)定抑菌直徑，結(jié)果見(jiàn)表3。

從表3中可以看出，枯草芽孢桿菌L1的發(fā)酵液經(jīng)20℃、-20℃和121℃分別處理后，菌株L1發(fā)酵液的抑菌效果在0.01水平上差異不顯著，說(shuō)明枯草芽孢桿菌L1起抑菌作用的活性物質(zhì)受溫度影響較小，對(duì)溫度不敏感。

2．4抗菌粗蛋白對(duì)水稻紋枯病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

抗菌粗蛋白質(zhì)采用(NH₄)₂SO₄分級(jí)沉淀法提取后，測(cè)定其對(duì)水稻紋枯病菌的抑菌作用，結(jié)果見(jiàn)表4。

從表4可以看出，硫酸銨粗蛋白分離純化后的7個(gè)梯度的粗蛋白對(duì)水稻紋枯病菌菌絲均具有一定的抑制作用，其中硫酸銨飽和度達(dá)60％～70％(不含60％)和其他梯度的存在顯著差異，其抑制效果最好，平均抑菌半徑達(dá)1.15 cm，說(shuō)明枯草芽孢桿菌L1分泌的抑菌蛋白主要集中在硫酸銨飽和度達(dá)60％～70％(不含60％)沉淀的活性物質(zhì)中，其活性物質(zhì)有待于進(jìn)一步深入研究。

2．5枯草芽孢桿菌L1對(duì)部分植物種子和果實(shí)致病性的測(cè)定

為測(cè)定枯草芽孢桿菌L1對(duì)田間其他作物是否有致病能力。觀察其致病性。用枯草芽孢桿菌L1的發(fā)酵液對(duì)玉米、大豆、小麥、水稻種子及番茄、菜豆、黃瓜果實(shí)進(jìn)行浸泡處理，果實(shí)96 h、種子待發(fā)芽后觀察表觀特征，結(jié)果見(jiàn)表5。

從表5結(jié)果可以看出，枯草芽孢桿菌L1對(duì)玉米、大豆、小麥、番茄、菜豆、黃瓜、水稻均無(wú)致病作用，而且對(duì)小麥、水稻種子發(fā)芽和生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，對(duì)黃瓜和番茄有一定的保鮮作用，其機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。

3結(jié)論

枯草芽孢桿菌L1的抑菌譜比較廣，尤其對(duì)水稻紋枯病菌、大豆菌核病菌、禾谷鐮孢菌、辣椒灰霉病菌、玉米小斑病菌抑菌效果較好。

枯草芽孢桿菌L1不同培養(yǎng)時(shí)間的發(fā)酵液經(jīng)濕熱滅菌處理后，對(duì)水稻紋枯病菌菌絲生長(zhǎng)抑制率存在差異，培養(yǎng)5 d發(fā)酵液與6、7、10 d的差異不顯著，而與4 d以前的差異顯著，說(shuō)明培養(yǎng)5 d時(shí)培養(yǎng)液中抑菌物質(zhì)含量達(dá)到平衡，抑菌效果最好，抑菌率為83.23％。

枯草芽孢桿菌L1的發(fā)酵液經(jīng)20℃、-20℃和121℃分別處理后，其對(duì)水稻紋枯病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率在0.01水平上差異不顯著，說(shuō)明枯草芽孢桿菌L1起抑菌作用的活性物質(zhì)受溫度影響不大，對(duì)溫度不敏感。

采用硫酸銨梯度沉淀法沉淀枯草芽孢桿菌L1分泌的蛋白，7個(gè)梯度沉淀的蛋白對(duì)水稻紋枯病菌生長(zhǎng)的影響不同，其中硫酸銨飽和度達(dá)60％～70％(不含60％)沉淀的活性物質(zhì)抑菌效果最好，平均抑菌半徑達(dá)1.15 cm，說(shuō)明枯草芽孢桿菌L1分泌的抑菌蛋白主要集中在硫酸銨飽和度達(dá)60％～70％(不含60％)沉淀的蛋白。

枯草芽孢桿菌L1對(duì)玉米、大豆、小麥、番茄、菜豆、黃瓜、水稻無(wú)致病性。

4討論

枯草芽孢桿菌L1的抑菌譜廣泛，且對(duì)多種田間作物重要病原菌有較好抑制效果，為芽孢桿菌L1的進(jìn)一步應(yīng)用研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

枯草芽孢桿菌L1培養(yǎng)5 d時(shí)培養(yǎng)液中抑菌物質(zhì)含量達(dá)到平衡，抑菌效果最好，隨時(shí)間延長(zhǎng)其分泌的抑菌活性物質(zhì)不再增加，抑菌活性物質(zhì)對(duì)溫度不敏感，該特性對(duì)菌株L1的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。

從上述表2和表3可以看出，枯草芽孢桿菌L1發(fā)酵液直接滅菌和用細(xì)菌濾器過(guò)濾菌體后進(jìn)行滅菌，前者抑菌效果明顯高于后者，說(shuō)明枯草芽孢桿菌L1產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)可能還有胞內(nèi)物質(zhì)，下一步進(jìn)行深入研究。

枯草芽孢桿菌L1分泌的抑菌蛋白主要集中在硫酸銨飽和度達(dá)60％～70％(不含60％)沉淀的活性物質(zhì)，在其他飽和度下也有抑菌物質(zhì)存在，說(shuō)明枯草芽孢桿菌L1產(chǎn)生并非一種抑菌活性物質(zhì)，抑菌活性物質(zhì)的種類和數(shù)量有待于進(jìn)一步研究。

枯草芽孢桿菌L1對(duì)多種作物無(wú)致病能力為該菌株今后能在田間進(jìn)行下一步試驗(yàn)提供保證；另外，枯草芽孢桿菌L1對(duì)黃瓜和番茄有一定的保鮮作用，且對(duì)灰霉病菌也有較好的拮抗作用，因此可以向蔬菜保鮮劑方面進(jìn)行擴(kuò)展。