趙　琳等

摘要：2006年從遼寧省不同地區(qū)采集蔬菜灰霉病果或病葉，經(jīng)分離共獲得灰霉病菌株86株。采用菌絲生長速率法測定了其對嘧霉胺的敏感性。試驗結(jié)果表明，灰霉病菌對嘧霉胺產(chǎn)生中等水平抗藥性，抗性頻率為17.41％。經(jīng)紫外、藥劑聯(lián)合誘導獲得了高抗菌株，抗性倍數(shù)最高達62.78倍。嘧霉胺與多菌靈和腐霉利間不存在交互抗藥性，苯胺基嘧啶類殺菌劑之間存在交互抗性。野生抗性菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性，連續(xù)轉(zhuǎn)接9次后抗藥性無明顯下降。不同菌株的菌絲生長速度、鮮重和產(chǎn)孢量存在明顯差異，但該差異與灰霉病菌對嘧霉胺的敏感性無相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：灰葡萄孢菌；嘧霉胺；抗藥性

中圖分類號

由灰葡萄孢菌引起的番茄灰霉病是保護地蔬菜生產(chǎn)上危害最嚴重的病害之一。自20世紀70年代以來，生產(chǎn)上相繼用多菌靈、腐霉利、乙烯菌核利等殺菌劑防治該病害，但病原菌在短時間內(nèi)陸續(xù)對這些殺菌劑產(chǎn)生了抗藥性，甚至出現(xiàn)了多重抗藥性菌株，田間防效明顯下降。嘧霉胺(pyrimethanil)是嘧啶胺類殺菌劑，對灰霉病特效，兼有保護和治療作用。20世紀90年代初，嘧霉胺率先在歐洲大面積推廣，用以防治葡萄、草莓等作物的灰霉病。1998年嘧霉胺在我國首次獲得農(nóng)藥登記，同年開始在遼寧省保護地番茄推廣使用。本試驗旨在測定遼寧省蔬菜灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性水平，并研究抗藥性菌株的生物學特性。

1、材料與方法

1.1供試材料

供試菌株：2006年3～5月，自遼寧省沈陽、鞍山、大連、遼陽、朝陽、撫順、本溪、鐵嶺8個城市的溫室中，采集已經(jīng)使用過嘧霉胺卻發(fā)生灰霉病的病果或病葉。在PDA培養(yǎng)基上分離灰葡萄孢菌，共獲得代表性菌株86株。殺菌劑：95.5％嘧霉胺原藥(昆山瑞澤農(nóng)藥股份有限公司)；90.5％多菌靈原藥(沈陽農(nóng)藥廠生產(chǎn))；50％腐霉利可濕性粉劑(速克靈，日本住友化學工業(yè)株式會社生產(chǎn))；50％嘧菌環(huán)胺水分散劑(先正達公司生產(chǎn))。

1.2灰霉病菌對嘧霉胺敏感性的測定

采用菌絲生長速率法測定各菌株的EG。值。培養(yǎng)基采用L-asp：K₂HPO₄、MgSO₄·7H₂O各1 g，KCl0.5 g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.01 g，L-天冬酰胺2 g，葡萄糖22 g，瓊脂20 g，加蒸餾水至1 L?；移咸焰邔︵酌拱返拿舾行詣澐謽藴剩寒斈尘甑腅G。<0.4μg／mL時，為敏感菌株(S)；當0.45≤EC₅₀<0.90μg／mL時，為中抗菌株(MR)；當EC₅₀≥0.90μg／mL時，為高抗菌株(HR)。

1.3紫外、藥劑聯(lián)合誘導抗藥性

在含有嘧霉胺不同濃度及對照的L-asp培養(yǎng)基平板上，涂抹0.1 mL供試菌株C₂、H₉、F₃₅的分生孢子懸浮液，涂勻后25℃培養(yǎng)2 h。然后置于穩(wěn)定紫外燈(25 W)400 mm下照射，照射時間分別為30、60、90、120 s。然后放入恒溫培養(yǎng)箱25℃培養(yǎng)3 d，數(shù)每個平板長出的菌落數(shù)，挑取長出的菌落邊緣置于含1 μg／mL嘧霉胺L-asp平板上，能夠生長的菌落即為抗藥性突變體。

1.4嘧霉胺與嘧菌環(huán)胺、多菌靈和腐霉利的交互抗藥性測定

采用菌絲生長速率法，測定多菌靈和腐霉利對HH₉、H₅、F₂₂、F₇₉、C₁₁、H₁₁共6株灰霉病菌分別將嘧霉胺與嘧菌環(huán)胺、多菌靈及腐霉利的EC₅₀作直線相關(guān)分析。

1.5抗性菌株遺傳穩(wěn)定性測定

將野生中抗菌株H₄和室內(nèi)誘導獲得的高抗菌株HH₉接種到無藥平板上，連續(xù)轉(zhuǎn)接9次，分別測定第3、6、9次轉(zhuǎn)接菌對嘧霉胺的敏感性。

1.6不同敏感性菌株生物學特性測定

菌絲生長速度：將HH₉、H₄、H₉、H₂、F₂₂、C₁₀6株灰霉病菌的菌碟分別置于無藥平板上，25℃培養(yǎng)3 d后，測量菌落直徑。菌絲鮮重：將6株灰霉病菌菌碟放入裝有50 mL液體培養(yǎng)基的三角瓶中，22℃、130 r／min振蕩培養(yǎng)5 d，菌絲過濾清洗后，測量鮮重。產(chǎn)孢量：將6株灰霉病菌菌碟移入PSA平板上，22℃培養(yǎng)15 d，每皿中加入10 mL無菌水，沖洗孢子，過濾，得孢子懸浮液，用血球計數(shù)板記錄孢子數(shù)。

2、結(jié)果與分析

2.1灰霉病菌對嘧霉胺的敏感性

經(jīng)分離共獲得代表嘧霉胺不同使用歷史的灰霉病菌86株，采用菌絲生長速率法測定嘧霉胺對各菌株的EC₅₀。結(jié)果表明，其中9株屬中抗菌株，占測定菌株的10.47％，6株屬高抗菌株，占測定的6.98％。以F₆₆最敏感，EC₅₀為0.037 2μg／mL，C₁₃抗性最大，EC₅₀達到3.161μg／mL。

2.2灰霉病菌對嘧霉胺誘導抗藥性

采用紫外、藥劑聯(lián)合誘導，供試菌株全部被誘導為高抗菌株(表1)，EC₅₀最高達5.719 5μg／mL，是敏感基線0.091 1的62.78倍。

2.3嘧霉胺與嘧菌環(huán)胺、多菌靈和腐霉利的交互抗藥性

交互抗性研究結(jié)果見圖1。嘧霉胺與多菌靈及嘧霉胺與腐霉利間EC₅₀的相關(guān)系數(shù)分別為0.123 6和0.002 2，在p=0.05水平上均不顯著，說明嘧霉胺與多菌靈及嘧霉胺與腐霉利間不存在交互抗藥性。嘧霉胺與嘧菌環(huán)胺間EC₅₀的相關(guān)系數(shù)為0.968 4，在p=0，05水平上差異顯著，說明嘧霉胺與嘧菌環(huán)胺問存在正交互抗性。

2.4抗性菌株遺傳穩(wěn)定性

室內(nèi)誘導高抗菌株HH。及野生中抗菌株H₄在無藥平板上連續(xù)轉(zhuǎn)接，其EC₅₀值逐漸下降(見表2)。轉(zhuǎn)接9次后，HH₉的EC₅₀值降低了67.9倍。而H₄的EC₅₀值下降緩慢，始終保持著對嘧霉胺的中等抗藥性，表明野生抗性菌株有較好的遺傳穩(wěn)定性。

2.5不同敏感性菌株的生物學特性

從表3可以看出，對嘧霉胺敏感性不同的灰霉病菌菌株的生長速度、菌絲鮮重、產(chǎn)孢量有所差異，有的菌株間甚至達到顯著水平。將其分別與相應菌株的ECs。作直線相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)分別為0.412 6、0.508 7和0.796 2，在p=0.05水平上均不顯著，說明這些生物學特性差異與敏感性無相關(guān)性，即抗性菌株與敏感菌株具有相同的適應性。

3、結(jié)論與討論

試驗結(jié)果表明，遼寧省灰霉病菌已對嘧啶胺類殺菌劑嘧霉胺產(chǎn)生抗藥性，但仍處于中等抗性水平，平均抗藥性頻率達17.41％；不同地區(qū)抗藥性頻率存在差異，嘧霉胺使用較多的沈陽市、遼陽市、大連市和鞍山市抗藥性頻率較高。在離體條件下，抗藥性菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性及與敏感菌株相似的適應性，這意味著抗藥性菌株在田間具有較高的適合度，如果嘧霉胺長期、連續(xù)使用將導致抗藥性菌株比例上升，防治失敗。

苯并咪唑類殺菌劑多菌靈與二甲酰亞胺類殺菌劑腐霉利作為防治灰霉病的主要藥劑在許多蔬菜產(chǎn)地已產(chǎn)生抗藥性。交互抗性測定結(jié)果表明，此二類殺菌劑與嘧霉胺不存在交互抗性，可以用來治理對多菌靈和腐霉利產(chǎn)生抗性的灰霉病菌。嘧啶胺類殺菌劑嘧菌環(huán)胺目前尚未在遼寧省大面積推廣使用，從其與同類殺菌劑嘧霉胺之間存在正交互抗性結(jié)果看出，灰霉病菌也可能對嘧菌環(huán)胺產(chǎn)生抗藥性。因此，為延緩其抗性產(chǎn)生，建議與不同作用機制的殺菌劑輪換使用，制定合理的用藥次數(shù)與頻率。

嘧霉胺作用位點單一，屬高抗藥性風險殺菌劑。近年已有多篇關(guān)于灰葡萄孢菌對嘧霉胺產(chǎn)生抗藥性的報道，甚至出現(xiàn)了高抗藥性菌株。嘧霉胺在遼寧省目前仍是防治灰霉病的有效藥劑。但許多農(nóng)民習慣于連年使用同種殺菌劑，且一季噴灑多次，這給病原菌產(chǎn)生抗藥性創(chuàng)造了極為有利的條件，為延長嘧霉胺的使用壽命，避免因產(chǎn)生嚴重抗性給生產(chǎn)造成重大損失，建議根據(jù)不同地區(qū)的抗藥性水平積極采取相應措施，如推廣綜合防治技術(shù)、減少每季用藥次數(shù)、與不同作用機制的殺菌劑復配或交替使用等。