馬麗麗等

摘要：測(cè)定了發(fā)光桿菌NJ菌株對(duì)16種植物病原真菌的抑菌活性，結(jié)果表明該細(xì)菌具有較廣的抑菌譜，其中對(duì)甘藍(lán)黑斑病菌、玉米大斑病菌、番茄猝倒病菌、玉米小斑病菌等植物病原真菌具有較強(qiáng)抑制作用。對(duì)該菌的發(fā)酵條件研究表明，該菌在種齡為24 h、接種量在4％～6％條件下，在TSY培養(yǎng)液中72 h即可獲得較高的抑菌活性。而裝瓶量為10～50 mL／100 mL錐形瓶，轉(zhuǎn)速為120～200 r／min對(duì)菌的活性影響不大。不同溫度處理發(fā)酵液，其抑菌活性發(fā)生變化，其中經(jīng)60℃處理10 min后，抑菌活性降低約50％，說明發(fā)酵液中的抑菌活性成分可能有多種。

關(guān)鍵詞：發(fā)光桿菌；植物病原真菌；抑菌活性；培養(yǎng)條件

中圖分類號(hào)：S 476，11

發(fā)光桿菌是一類與異小桿屬昆蟲病原線蟲互惠共生的細(xì)菌。該菌存在于昆蟲病原線蟲3齡侵染期幼蟲的腸道中，以線蟲為載體侵入昆蟲并被釋放到昆蟲血腔內(nèi)進(jìn)行大量繁殖，隨后產(chǎn)生毒素和抑菌物質(zhì)，使昆蟲患敗血癥死亡；同時(shí)產(chǎn)生抗生素，抑制其他雜菌的二次污染，為線蟲的生長(zhǎng)繁殖提供良好的生存環(huán)境，這一特性引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的興趣，并進(jìn)行了大量的研究。研究表明，共生細(xì)菌能夠產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物，抑制其他微生物的生長(zhǎng)，尤其對(duì)植物病原真菌具有普遍的抑制作用。目前，已從共生細(xì)菌中分離鑒定出30多種具有生物活性的代謝產(chǎn)物。從發(fā)光桿菌屬中分離得到的抑菌物質(zhì)主要有蒽醌類、羥化二苯乙烯類、細(xì)菌素(bacteriocin)和幾丁質(zhì)酶類。

陸秀君等人測(cè)定了發(fā)光桿菌HBgyl3對(duì)蔬菜病原菌的抑制活性，發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)黃瓜灰霉病菌(Botrytis cinerea)和蘿卜褐腐病菌具有較好的抑制效果。本文通過對(duì)植物病原真菌的篩選得到發(fā)光桿菌NJ菌株，為了提高該菌株產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的水平，從而為發(fā)揮共生菌的最大生產(chǎn)潛能提供支持并對(duì)抑菌物質(zhì)性質(zhì)進(jìn)行初步了解，對(duì)NJ菌株的發(fā)酵條件和抑菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性進(jìn)行研究。

1、材料與方法

1.1供試菌株

供試植物病原真菌：甘藍(lán)黑斑病菌、玉米大斑病菌、蔥紫斑病菌、番茄猝倒病菌、番茄葉霉病菌、大豆灰斑病菌、玉米小斑病菌、黃瓜枯萎病菌、大豆紫斑病菌、大豆根腐病菌、大豆菌核病菌、大豆根腐病菌、亞麻枯萎病菌、長(zhǎng)蠕孢、鏈格孢、大豆黑斑病菌等由中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所提供。

供試共生細(xì)菌：發(fā)光桿菌NJ菌株，由本試驗(yàn)室保存的異小桿屬昆蟲病原線蟲(Heterorhabditisbacteriophora)體內(nèi)直接分離獲得。取被昆蟲病原線蟲侵染的大蠟螟幼蟲體液，轉(zhuǎn)接于NBTA上，28℃恒溫畫線培養(yǎng)48 h，平板上出現(xiàn)的藍(lán)色單菌落為所需工型共生細(xì)菌。

1.2供試培養(yǎng)基

NBTA：營(yíng)養(yǎng)瓊脂45g，溴百里酚蘭0.025g，氯化三苯基四氮唑0.04g，水1000mL；

TSY：酵母膏5g，TSB40g，水1000mL，pH7.2～7.4：

TSB：大豆胨5g，胰蛋白胨15g，NaCl5g，水1 000 mL，pH7，2～7.4；

LB：胰蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，水1000mL，pH7.2～7，4；

NB：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，水1000mL，pH7.2～7.4。

1.3發(fā)光桿菌NJ菌株抑菌活性測(cè)定

采用點(diǎn)接法，在PDA平板的中央接種玉米大斑病菌菌塊，用接種針挑取NBTA平板上的初生型發(fā)光桿菌NJ單菌落，點(diǎn)接種于平板上距病原真菌菌塊中心3 cm處。待對(duì)照病原菌菌絲生長(zhǎng)到達(dá)接人點(diǎn)形成較明顯的抑菌帶或抑菌圈時(shí)，測(cè)定比較各抑菌圈的大小。

1.4培養(yǎng)條件對(duì)NJ菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響

對(duì)NJ菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，通過改變不同的培養(yǎng)參數(shù)，培養(yǎng)基、培養(yǎng)時(shí)間、接種量、種齡以及通氣量等，探討各指標(biāo)對(duì)NJ菌株生長(zhǎng)及抑菌活性的影響。

1.5發(fā)酵液抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性測(cè)定

將制備的NJ菌株72 h發(fā)酵液分別經(jīng)不同溫度(28、40、60、80、100℃)水浴處理10 min后，測(cè)定各處理液的抑菌圈直徑。

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行方差分析。

2、結(jié)果與分析

2.1發(fā)光桿菌NJ菌株對(duì)病原菌的抑制作用

測(cè)定結(jié)果表明，發(fā)光桿菌NJ菌株對(duì)16種植物病原菌均有不同程度的抑制作用，抑菌圈直徑差異較大，最小的僅為2.2 mm，最大的可達(dá)19.0 mm。其中對(duì)甘藍(lán)黑斑病菌、玉米大斑病菌、蔥紫斑病菌、番茄猝倒病菌、玉米小斑病菌及大豆灰斑病菌均有較強(qiáng)的抑制效果(表1)，抑菌圈直徑達(dá)14mm以上。

2.2培養(yǎng)條件對(duì)NJ菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響

2.2.1培養(yǎng)基對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響

將制備的24 h種子液以4％的接菌量分別接入NB、LB、TSY、TSB培養(yǎng)液中，28℃，120 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)72 h，預(yù)定各處理的A₆₀₀及抑菌圈直徑。結(jié)果表明：不同培養(yǎng)液對(duì)于菌的生長(zhǎng)影響較大，各處理A₆₀₀差異顯著(p≤0，05)。NJ菌株在TSY培養(yǎng)液中生長(zhǎng)最好，菌群密度最大，A₆₀₀為3.033，在NB培養(yǎng)液中生長(zhǎng)72 h后，菌體的密度最小，其A₆₀₀只有2.060。除TSB的抑菌活性稍低外，其他3種培養(yǎng)液的抑菌活性差異不大?？赡苁怯捎谠谂囵B(yǎng)液中加入酵母抽提物有利于菌的生長(zhǎng)以及抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生(圖1)。

2.2.2培養(yǎng)時(shí)間對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響

將制備的24 h種子液以4％的接菌量接人TSY培養(yǎng)液中，28℃，120 r/min，分別培養(yǎng)24、48、72、96、120、144 h，測(cè)定發(fā)酵液的A₆₀₀及抑菌活性。結(jié)果表明：培養(yǎng)時(shí)間在24～72 h范圍內(nèi)，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，發(fā)酵液的菌體濃度及抑菌活性逐漸增加，在72 h達(dá)到最大值，A₆₀₀為3.100，且菌體生長(zhǎng)曲線與抑菌活性曲線基本一致。之后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，A₆₀₀及抑菌活性變化不大(圖2)。細(xì)菌生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期后，菌體密度基本保持穩(wěn)定，而此時(shí)產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)也達(dá)到一種平衡狀態(tài)，說明在其他培養(yǎng)參數(shù)一定的情況下，抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)量與菌體密度成正比，菌體密度越大，抑菌活性越高。

2.2.3種子液對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響

在滅菌的裝有10 mL TSY培養(yǎng)液的錐形瓶中接入NJ菌株I型單菌落，在28℃，120 r/min條件下，分別發(fā)酵培養(yǎng)12、16、20、24 h和28 h作為種子液，以4％的接菌量接入培養(yǎng)液中，相同條件下發(fā)酵72 h，測(cè)定發(fā)酵液的A₆₀₀及抑菌圈直徑。結(jié)果表明：

在12～28 h種齡范圍內(nèi)，各處理的A60。及抑菌活性差異顯著(p≤0.05)。12～28 h范圍內(nèi)種子液的A₆₀₀呈上升趨勢(shì)，從0.253升到2.055。隨著種齡的增加，發(fā)酵液的抑菌活性增強(qiáng)，以24 h種子液接種的發(fā)酵液抑菌活性最高，達(dá)到最高峰(圖3)，隨后抑菌活性呈下降趨勢(shì)，這可能是與不同時(shí)間種子液菌體的生長(zhǎng)狀態(tài)有關(guān)，此時(shí)菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，適應(yīng)力強(qiáng)，代謝快，因而當(dāng)種子液接種到培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)更有利于菌的生長(zhǎng)以及抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生。

2.2.4接菌量對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響

分別以1％、2％、4％、6％、8％、10％的接菌量向培養(yǎng)液中加入24 h種子液，28℃，120 r/min發(fā)酵培養(yǎng)72 h，測(cè)定發(fā)酵液的A₆₀₀及其抑菌活性。結(jié)果表明：1％～10％的接菌量對(duì)于菌的生長(zhǎng)無影響，各處理間Aso。值差異不顯著(p≥0.05)。接菌量為4％時(shí)發(fā)酵液的抑菌圈直徑最大，抑菌活性最高，抑菌圈直徑達(dá)15.60mm，隨著接菌量的增加，抑菌活性有降低趨勢(shì)，接菌量為8％時(shí)，抑菌圈直徑僅為13.60mm(圖4)。

2.2.5通氣量對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響

在對(duì)菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)的過程中，轉(zhuǎn)速和裝瓶量是影響通氣量的兩個(gè)因素。由此可以推斷該菌對(duì)氧氣的需求程度。

2.2.5.1轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響

將發(fā)酵液置于28℃，在不同的轉(zhuǎn)速條件120、160、200 r/min，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)72 h，測(cè)定發(fā)酵液的A₆₀₀及抑菌活性。結(jié)果表明：轉(zhuǎn)速在120～200 r/min范圍內(nèi)，菌體密度與發(fā)酵液的抑菌活性差異不顯著(表2)，說明轉(zhuǎn)速不影響菌的生長(zhǎng)及抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生。

2.2.5.2裝瓶量對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響

在100 mL錐形瓶中分別加入10、20、30、40、50 mL培養(yǎng)液，以4％的接菌量接入24 h種子液，培養(yǎng)72 h，測(cè)定各發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵液的A₆₀₀及抑菌活性。結(jié)果表明：不同裝瓶量處理對(duì)菌體生長(zhǎng)及抑菌活性無顯著影響(圖5)，各處理的A₆₀₀在3.000左右，抑菌圈直徑均在15.00mm左右。

由此推測(cè)，通氣量并不是影響共生菌生長(zhǎng)及抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)生的主要因素。

2.3抑菌活性成分穩(wěn)定性測(cè)定

將制備的72 h發(fā)酵液分別經(jīng)28、40、60、80、100℃恒溫水浴處理10 min，測(cè)定各處理的抑菌圈直徑。結(jié)果表明：原液與不同溫度處理發(fā)酵液的抑菌活性差異顯著，28℃發(fā)酵液的抑菌圈直徑達(dá)16.00 mm，而經(jīng)60℃處理后，發(fā)酵液的抑菌圈直徑為9.00 mm，抑菌活性降低了約50％(圖6)。經(jīng)60、80、100℃處理的發(fā)酵液抑菌活性差異不顯著。說明抑菌物質(zhì)部分可能為蛋白類等對(duì)熱不穩(wěn)定的物質(zhì)，而還有一部分物質(zhì)可能是對(duì)熱穩(wěn)定的抗生素類物質(zhì)。

3、結(jié)論與討論

本研究對(duì)從異小桿屬昆蟲病原線蟲中分離的NJ菌株進(jìn)行了抑菌活性測(cè)定，結(jié)果表明該菌株對(duì)多種植物病原菌具有較好的抑制效果。研究發(fā)現(xiàn)，NJ菌株在含有酵母抽提物的培養(yǎng)液中更有利于菌的生長(zhǎng)。發(fā)酵液的抑菌活性與菌體的生長(zhǎng)基本保持一致，在72 h達(dá)到最大值，此后，抑菌活性基本維持穩(wěn)定。轉(zhuǎn)速在120～200 r/min，裝瓶量為10～50 mL/100 mL容量瓶對(duì)菌的生長(zhǎng)及抑菌活性無顯著影響。種齡在24 h，接種量為4％～6％時(shí)菌的抑菌活性較高。

發(fā)光桿菌是一類生活于昆蟲病原線蟲體內(nèi)的特殊細(xì)菌，因而對(duì)于培養(yǎng)條件具有特殊的要求。對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，有利于提高此類細(xì)菌的產(chǎn)素水平，增強(qiáng)其抑菌活性。本文分析了培養(yǎng)條件對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響，而由于此類細(xì)菌存在兩型現(xiàn)象，只有初生型能夠產(chǎn)生抗生素類物質(zhì)，要進(jìn)一步提高該菌產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的能力，需要對(duì)其型變現(xiàn)象進(jìn)行進(jìn)一步的研究。