丁　中等

摘要：線蟲乙酰膽堿酯酶(ACHE)以多種不同的分子型存在并由不同的基因所編碼。本綜述簡述了線蟲AChE的藥理學(xué)特性、分子型以及相關(guān)ace基因的結(jié)構(gòu)、分布和功能。

關(guān)鍵詞：線蟲；乙酰膽堿酯酶；分子型；ace基因

中圖分類號Q 78：S 432，45

線蟲依靠沿蟲體體壁縱向排列的背肌帶和腹肌帶的收縮而獲得蠕行的動力。在線蟲的腹神經(jīng)索和背神經(jīng)索存在神經(jīng)一肌肉突觸，通過興奮性神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(ACh)以調(diào)節(jié)肌肉活動。乙酰膽堿酯酶是生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的一種關(guān)鍵性的酶，在膽堿能突觸間，該酶降解乙酰膽堿，終止神經(jīng)遞質(zhì)對突觸后膜的興奮作用，保證神經(jīng)信號在生物體內(nèi)的正常傳遞。當(dāng)AChE受到有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類藥劑抑制時(shí)，ACh在突觸內(nèi)聚集，先引起突觸后膜乙酰膽堿受體的高度興奮，然后產(chǎn)生去極化作用，導(dǎo)致蟲體麻痹。植物寄生線蟲麻痹后，由于不能找到寄主和食物而死亡。動物寄生線蟲如巴西日圓線蟲(Nippostrongylus brasiliensis)等，AChE除了其正常的神經(jīng)學(xué)功能外，它還是一種分泌性產(chǎn)物，但對于分泌性AChE的生理功能目前仍有爭議。當(dāng)AChE受到抑制同樣將導(dǎo)致線蟲麻痹，使動物寄生線蟲從宿主體內(nèi)排出。

1、線蟲AChE的分子型(molecular forms)

過去曾長期認(rèn)為線蟲和大多數(shù)無脊椎動物、所有的脊椎動物一樣均由單基因編碼AChE并只有單一分子型，但通過對自由生活線蟲秀麗小桿線蟲(Caenorhabditis elegans)，動物寄生線蟲如捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchus contortus)、蛔蟲(Ascarislumbricoides)等和植物寄生線蟲如南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)、大豆胞囊線蟲(Heterodera glycines)等的研究表明，線蟲的AChE以多種分子型存在。對其分子結(jié)構(gòu)分析表明，這些形式的酶不具有其他種類動物中常見的、與許多AChE有關(guān)的膠原尾，而是球形的單體(G1)、二聚體(G2)和四聚體(G4)，并依據(jù)其溶解性又可分為兩親分子(amphiphilic)和非兩親分子(nonamphipilic)。這些分子型又組成了AChE的不同類型，并由多種基因所編碼，其編碼不同的動力學(xué)類型在底物的親和性、對抑制劑的敏感性等性質(zhì)方面均有明顯不同。這些酶類在線蟲體內(nèi)量的多少和分布可能是影響抑制劑對線蟲行為作用的重要因素，并發(fā)現(xiàn)許多種動物寄生線蟲能通過側(cè)器腺體活躍地分泌AChE。這些分泌性AChE與在神經(jīng)一肌肉突觸間的AChE有著明顯的差異。

2、線蟲AChE的藥理學(xué)特性

氨基甲酸酯類和有機(jī)磷類殺線蟲劑與AChE的結(jié)合方式類似于天然底物，首先形成一個(gè)復(fù)合體，然后AChE活性部位的絲氨酸殘基被氨基甲酰酯化或磷?；@就造成了酶的被抑制。早期的研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類殺線蟲劑的一個(gè)共同特征是具有與AChE作用的可逆性。幾種植物寄生線蟲經(jīng)有機(jī)磷和氨基甲酸酯抑制劑作用后可恢復(fù)活動。如燕麥真滑刃線蟲(Aphelenchus avenae)經(jīng)涕滅威作用72 h后再經(jīng)過在蒸餾水中48 h的恢復(fù)，線蟲AChE的活性恢復(fù)率高達(dá)98％，而經(jīng)苯線磷作用后的恢復(fù)率僅約6％。秀麗小桿線蟲經(jīng)氨基甲酸酯類和有機(jī)磷類作用24 h后，線蟲AChE的恢復(fù)迅速，其中涕滅威作用過的線蟲經(jīng)24 h的恢復(fù)期后，線蟲的AChE活性幾乎完全恢復(fù)，但經(jīng)苯線磷抑制的線蟲在24 h恢復(fù)期后，與未經(jīng)藥物作用的線蟲相比，僅觀察到約10％的AChE活性，但這樣小量的AChE活性恢復(fù)已足以使線蟲恢復(fù)正?；顒?。

經(jīng)氨基甲酸酯類殺蟲劑麻痹的線蟲與未經(jīng)藥劑作用的線蟲相比，前者仍具有較高的AChE活性。氨基甲酸酯類涕滅威抑制AChE活性的動力學(xué)試驗(yàn)證明，抑制表現(xiàn)出兩個(gè)階段，即約50％AChE活性喪失較快，而剩余的部分則被抑制得較慢。在經(jīng)長達(dá)24 h的持續(xù)作用后，線蟲的AChE可被完全抑制。基于以上現(xiàn)象的觀察和采用去污劑皂甙所做的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，Russell曾猜測AChE可能存在于兩個(gè)室(compartment)內(nèi)，并由脂膜分隔開，第1室可能存在于神經(jīng)一肌肉突觸，AChE可迅速失活，是與線蟲行為相關(guān)的部分；第2室AChE的被抑制極為緩慢，可能與線蟲行為無關(guān)。但后來認(rèn)為，這是由于線蟲中存在對抑制劑具有高度抗性的AChE類型所致。

3、線蟲AChE的基因結(jié)構(gòu)、功能和組織分布

近年來對多種線蟲尤其是以秀麗小桿線蟲為模式線蟲對AChE的相關(guān)基因進(jìn)行了克隆和測序，揭示了其結(jié)構(gòu)、組織的分布并推測了其分別演繹的功能。發(fā)現(xiàn)線蟲的乙酰膽堿酯酶由多種基因所編碼。對秀麗小桿線蟲的遺傳分析認(rèn)為編碼AChE的有4種基因ace-1、ace-2、ace-3和ace-4，分別編碼4種不同AChE類型。其基因結(jié)構(gòu)見圖1。在染色體X上的ace-1編碼ACE-1，染色體工上的ace-2編碼ACE-2，染色體Ⅱ上的ace-3編碼ACE-3。缺失ace-1或ace-2的秀麗小桿線蟲突變體在行動上僅有輕微的改變，而缺失ace-3的突變體則未觀察到行為或發(fā)育異常。缺失ace-1和ace-2線蟲運(yùn)動上表現(xiàn)出嚴(yán)重的不協(xié)調(diào)，缺失ace-1、ace-2和ace-3的3個(gè)基因的突變體則致死。

3.1ACE-1

編碼秀麗小桿線蟲ACE-1的ace-1基因與編碼人類以及電鰩(torpedo)的AChE基因具有42％的同源性，主要分布在線蟲的體壁肌細(xì)胞。秀麗小桿線蟲和Caenorhabditis briggsae的ACE-1是一個(gè)兩親分子四聚體，具有一疏水的非催化亞基，與脊椎動物的AChE催化亞基AChE(T)相類似，并在花生根結(jié)線蟲(M.arenaria)和南方根結(jié)線蟲中發(fā)現(xiàn)同樣也有該亞基。最近作者克隆并推導(dǎo)的甘薯莖線蟲(Ditylenchus destructor)乙酰膽堿酯酶ACE-1(待發(fā)表)與秀麗小桿線蟲、南方根結(jié)線蟲、胎生網(wǎng)尾線蟲(Dictyocaulus viviparus)的ACE-1高度同源。這些ACE的C-末端序列均具有色氨酸兩親分子四聚體(WAT)區(qū)域，該區(qū)具富含脯氨酸結(jié)合區(qū)(PRAD)。與秀麗小桿線蟲ACE-1基因序列中有8個(gè)保守芳香族氨基酸殘基相比較，南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和甘薯莖線蟲只有7個(gè)保守的芳香族氨基酸。

采用綠色熒光蛋白(GFP)報(bào)告基因結(jié)構(gòu)通過顯微注射法證明了秀麗小桿線蟲的ace-1表達(dá)的空間分布。觀察到ace-1在所有的體壁肌細(xì)胞、咽肌細(xì)胞pm5和頭部神經(jīng)中樞的3對感覺神經(jīng)元都有表達(dá)。咽肌細(xì)胞對取食非常重要。咽的汲動通過神經(jīng)元M5受膽堿能支配的調(diào)節(jié)，并發(fā)現(xiàn)ace-1、

ace-2均缺失的突變體咽功能有缺陷。研究發(fā)現(xiàn)ace-1在南方根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲的大多數(shù)生長階段都能表達(dá)，但在雌成蟲則未能檢測到。由于雌成蟲在植物根部組織是不遷移的，秀麗小桿線蟲缺失ace-1的突變體其咽部汲動功能并未受到影響。因此，ace-1的表達(dá)與否對根結(jié)線蟲雌成蟲的生存不是必需的。

3.2ACE-2

秀麗小桿線蟲的ACE-2是一種結(jié)合有糖基磷酯酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)結(jié)構(gòu)的兩親分子二聚體，其C末端是疏水的，與脊椎動物ACHE(H)結(jié)構(gòu)非常相似，都有一個(gè)GPI錨定位點(diǎn)并在錨定位點(diǎn)的上游含有一個(gè)半胱氨酸殘基，參與鏈間二硫鍵的形成。

從南方根結(jié)線蟲、胎生網(wǎng)尾線蟲(Dictyocaulusviviparus)和甘薯莖線蟲克隆的cDNA與秀麗小桿線蟲的ace-2均具有高度的同源性。但與秀麗小桿線蟲、南方根結(jié)線蟲和胎生網(wǎng)尾線蟲的ACE-2相比較，作者在甘薯莖線蟲ACE-2的C末端未發(fā)現(xiàn)半胱氨酸殘基。這是否意味著該酶活性的改變有待進(jìn)一步研究。

采用GFP報(bào)道基因顯微注射法表明ace-2與ace-1具有不同的表達(dá)部位：ace-2主要在頭部的感覺神經(jīng)細(xì)胞、pm5細(xì)胞以及肛門神經(jīng)節(jié)和真皮細(xì)胞下的運(yùn)動神經(jīng)元得到表達(dá)。而且ace-2是秀麗小桿線蟲賁門表達(dá)AChE的唯一基因。通過RT-PCR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，ace-2在南方根結(jié)線蟲的卵孵化前的一齡幼蟲及孵化后的生長階段包括雌、雄蟲均能表達(dá)。由于ace-1在南方根結(jié)線蟲雌成蟲則未能檢測到，因此推測ace-2可能與線蟲的取食有關(guān)。

3.3ACE-3和ACE-4

秀麗小桿線蟲的ace-3和ace-4兩基因均位于染色體Ⅱ，其間有356個(gè)核苷由ace-4的終止密碼子和ace-3的起始密碼子分離開來。ACE-3與GPI結(jié)構(gòu)相結(jié)合成兩親分子二聚體。ACE-1和ACE-2大約占線蟲總膽堿酯酶活性的95％，ACE-3的活性約占5％。Northern印跡分析發(fā)現(xiàn)幾乎檢測不到ace-4 mRNA，但顯示ace-3 mRNA的豐度較高。與電鰩的保守序列FGESAG相比較，秀麗小桿線蟲ACE-3不同的是VGESAG，表明該酶可能具有較低的催化效率。作者發(fā)現(xiàn)甘薯莖線蟲的ACE-3中該保守序列并未改變，與電鰩及秀麗小桿線蟲ACE-3的保守序列EDCLY相比較，甘薯莖線蟲的ACE-3該序列改變?yōu)镋NCLY，即127位天冬氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘於０?待發(fā)表)。秀麗小桿線蟲的ACE-4包含活性位點(diǎn)絲氨酸殘基的保守序列FGQSAG不同于其他ACE的FGESAG，即199位谷氨酸置換成了199位谷氨酰胺。ACE-4可能具有非催化活性功能。

秀麗小桿線蟲的ACE-3不同于其他分子型就在于它對ACh具有較低的K_m，并對抑制劑毒扁豆堿和氨基甲酸酯類殺線蟲劑涕滅威具有高度抗性。這與根結(jié)線蟲的ACE-C相類似，對有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類殺線蟲劑具有相當(dāng)高的抗性。由于ACE-3在線蟲的咽部肌細(xì)胞、頭部神經(jīng)元、肛門神經(jīng)節(jié)均有表達(dá)，這樣對于已建立取食點(diǎn)的線蟲在較高濃度的殺線蟲劑的存在下仍然能取食并持續(xù)存活，使得線蟲難以防治。

4、展望

秀麗小桿線蟲基因組的研究促進(jìn)了線蟲AChE基因的研究，其中包括了線蟲AChE基因的克隆、表達(dá)以及結(jié)構(gòu)和功能的研究。線蟲存在多個(gè)AChE基因已逐步被人們所認(rèn)識。但目前國內(nèi)外對線蟲AChE的研究還較少，對其基因調(diào)控、分子進(jìn)化、發(fā)育和生物學(xué)意義還不清楚。隨著分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)和生物信息學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，開展對植物寄生線蟲AChE的研究將有助于深入了解線蟲AChE的特性，為開發(fā)新的防治藥劑、途徑和方法提供新的理論依據(jù)。