高　芬　吳元華

摘要：綜述了近年來國內(nèi)外利用微生物制劑、植物源制劑及誘抗劑等對鏈格孢屬真菌引起的植物病害進行生物防治的研究進展，并對目前生物防治中存在的問題和應用前景作了評述。

關(guān)鍵詞：鏈格孢屬；植物病害；生物防治

中圖分類號S 432，44，S476，8

鏈格孢屬(Alternaria)真菌屬有絲分裂孢子真菌類群絲孢綱絲孢目，是引起植物病害的重要真菌類群之一。世界上已經(jīng)報道的鏈格孢屬真菌中近90％的種能夠兼性寄生于不同種植物，特別是農(nóng)作物，引起包括玉米、小麥、煙草、馬鈴薯、番茄、蘋果、梨等幾十種農(nóng)作物的病害，造成田間和產(chǎn)后損失。鏈格孢屬真菌由于兼有寄生和腐生性，可在低溫潮濕的環(huán)境下生長繁殖，還可在田間、運輸及儲藏過程中引起農(nóng)作物霉變，也是導致水果、蔬菜及冰箱儲存食品腐敗變質(zhì)的主要微生物。鏈格孢屬真菌可產(chǎn)生70多種有毒代謝產(chǎn)物一鏈格孢毒素，這些毒素是其作用于植物的主要致病因子，通過毒素的作用不僅使植物產(chǎn)生癥狀，造成危害，而且人和動物攝入被鏈格孢毒素污染的食品及飼料后還可導致急性或慢性中毒，某些鏈格孢毒素還有致畸、致癌、致突變作用。

進入21世紀后，生物防治的概念開始主導人們的思想，并成為病害防治研究中發(fā)展最快的領(lǐng)域。在各類生防措施中，生物農(nóng)藥的研究是最為活躍和成功的部分?，F(xiàn)將對鏈格孢屬真菌病害的生物防治概況綜述如下。

1、微生物源制劑

微生物源制劑是生物農(nóng)藥中研究最為深入、應用最為廣泛的一類。目前市售的防治植物真菌病害的生物制劑大部分來源于各類微生物，按照應用類型可分為活體微生物和微生物代謝產(chǎn)物兩類。

1.1活體微生物

活體微生物制劑的有效成分是細菌、真菌、病毒等微生物活體，它通過在自然界中篩選分離出對靶標有效的微生物活體菌進行液體或固體發(fā)酵制備而成。針對鏈格孢屬真菌病害應用于生產(chǎn)上的活體生防制劑報道不多，但在室內(nèi)、田間利用芽孢桿菌、假單孢桿菌、木霉、病原菌弱毒株等進行防治研究方面均有報道并取得了一定進展。

1.1.1細菌

拮抗細菌的利用中，芽孢桿菌由于具有很高的抗逆性，在特殊環(huán)境下易于存活而一直備受關(guān)注。近年來，內(nèi)生菌由于具有生存于植物體內(nèi)不易受環(huán)境條件的影響，有穩(wěn)定的生存空間，可以在其中定殖和運轉(zhuǎn)的優(yōu)勢，又成為新的研究熱點。研究表明：拮抗菌的生防機理包括競爭作用、拮抗作用、誘導植物抗性等方面，尤以產(chǎn)生抗生素、抑菌蛋白和揮發(fā)性抗菌物質(zhì)最為重要。

拮抗細菌的篩選范圍不僅包括土壤、寄主作物的根部、葉片等，還從發(fā)病部位如病斑上分離到了各類拮抗細菌，主要包括Pseudomonas spp.，Bacillusspp.，Rhodotorula glunitis和Serratia spp.等。防治的目標病害主要為煙草赤星病(Alternaria alternata)，同時開始涉及十字花科蔬菜黑斑病(A.brassicae，A.brassicicola，A.japonica)、蘋果霉心病(A alternata)、胡蘿卜黑腐病(A.radicina)、向日葵苗期萎蔫病(A.helianthi)、瓜類采后病害(A.alternata)等前期不為人們所關(guān)注的一些病害。高芬等針對番茄早疫病(A.solani)也篩選到了一些拮抗芽孢桿菌。以上這些拮抗細菌在室內(nèi)試驗中都表現(xiàn)出了良好的拮抗活性，可以進行進一步開發(fā)研究。

利用細菌對植物的誘導抗性作用防治鏈格孢屬真菌病害也有相關(guān)的報道。董漢松等研究表明：非病原細菌可以誘導煙草對赤星病的系統(tǒng)抗性，且抗性誘導效應與菌種來源沒有直接關(guān)系。H.S.A.Silva等選用拮抗番茄細菌斑點的根際細菌B101R、B212R和A068R作為誘導物，進行防治番茄葉部包括番茄早疫在內(nèi)的5種病害的試驗，防治效果因所研究的病害系統(tǒng)不同而有所差異。種子經(jīng)過根際細菌處理的番茄植株的葉提取物中，過氧化物酶和脂肪氧化酶活性增加，而苯丙氨酸解氨酶活性沒有增加。

1.1.2真菌

木霉(Trichoderma spp.)是世界上在植物病害生物防治中應用最多的微生物類群之一。木霉菌的生防機制主要為生長競爭、重寄生作用以及產(chǎn)生生物活性類物質(zhì)，如抗生素、幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、蛋白酶、甘露聚糖酶和其他水解酶。這些物質(zhì)被認為在木霉菌的生防作用中占主要地位。

王革等篩選到了對煙草赤星病有明顯拮抗作用的綠色木霉菌株Tv－1，該菌株菌絲生長迅速，能附著、纏繞于病菌菌絲上，并產(chǎn)生吸器侵入菌絲；同時還能分泌使病菌菌絲原生質(zhì)濃縮、斷裂、消解的物質(zhì)。夏振遠報道：玉溪紅塔集團技術(shù)中心與云南煙草科學研究院共同合作已開發(fā)出防治煙草赤星病的木霉制劑－滅菌寧。

在利用真菌的重寄生作用進行生防方面，除了研究較為深入的木霉以外，其他寄生性真菌的開發(fā)研究也有新的發(fā)現(xiàn)。G.Turhan利用光學和掃描電子顯微鏡進行的研究表明：Nectria inventa，Gliocladium roseum，G.catenulatum，Clonostach vssp.，Sesquicillium sp.，Verticillium nigrescens，Dicyma olivacea，Stachybotrys elegans，Myrotheciumcarmichaellii，M.cinctum，M.roridum，M.tongaense，M.verrucaria和Coniothyrium sporulosum能夠寄生Alternaria alternata。據(jù)此正在作為潛在的生防資源加以研究。

此外，利用真菌對植物的誘導抗性作用，文景芝等將從馬鈴薯上分離的A.solani菌株，用于對煙草赤星病菌的挑戰(zhàn)接種，在一定條件下也可誘導煙草植株對赤星病菌產(chǎn)生系統(tǒng)抗性。

1.1.3病毒

應用病毒弱毒株的交互抗性防治植物病害主要是用在植物病毒病的防治上，用于真菌病害防治的報道不是很多。董漢松等認為病毒因子可以誘導煙草對赤星病的系統(tǒng)抗性，并且經(jīng)弱病毒疫苗(N14、SV52)誘導獲得抗病性時，誘導抗性可以向再生植株傳遞。

1.2微生物代謝產(chǎn)物

微生物的代謝產(chǎn)物分為抗生素、幾丁質(zhì)酶、拮抗蛋白、抗菌多肽等，其中以抗生素的研究和應用最為廣泛。

1.2.1農(nóng)用抗生素

現(xiàn)有的抗生素中約80％左右是由微生物產(chǎn)生的，放線菌、細菌、真菌均能產(chǎn)生抗生素，但以放線菌產(chǎn)生的居多?？股卮蠹s占到生物農(nóng)藥總量的90％左右?？拐婢r(nóng)用抗生素主要作用于植物病原真菌細胞壁、菌體細胞膜、蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)、能量代謝系統(tǒng)等方面；有的還可提高植物的抗病力、抑制病菌的某些酶系統(tǒng)、改變病原菌的形態(tài)、阻礙菌體的糖代謝。

防治鏈格孢屬真菌病害的農(nóng)用抗生素首推日本

的多氧霉素和我國的多抗霉素。多抗霉素(polyoxin)是一種胞嘧啶核苷類抗生素，產(chǎn)生菌為可可鏈霉菌，主要組分為polyoxin A和polyoxin B，其作用位點是真菌的細胞壁。多抗霉素不僅對煙草赤星病、蘋果斑點落葉病、梨黑斑病等有特效，而且對瓜果類蔬菜上的猝倒病、立枯病、灰霉病、葉霉病等葉部病害和大田作物病害，如水稻紋枯病、稻瘟病等防效顯著。除此之外，目前還未見有新的大面積應用的產(chǎn)品報道，只有一些室內(nèi)、溫室的篩選研究。我國丁立孝、吳元華、儲慧清等分別篩選到了一些拮抗鏈霉菌，其產(chǎn)生的抗生素在室內(nèi)和溫室試驗中可有效防治煙草赤星病。王東昌等從枯草芽孢桿菌XMl6的發(fā)酵液中提取制備出一種抗菌素，室內(nèi)測定其5％可濕性粉劑的2000倍液，對3種蘋果霉心病的主要病原抑制效果明顯。高芬等從371株放線菌中，篩選到了2株在室內(nèi)和溫室試驗中對赤星病表現(xiàn)出良好抑菌防病效果的拮抗鏈霉菌，其中菌株182—2代謝產(chǎn)生的抗生素為一種堿性水溶性抗生素。

在國外，Pichard等從花椰菜種子上分離到Bacillus polymyxa，該菌可以通過產(chǎn)生抗生素起到控制花椰菜黑斑病的作用，用無菌上清液進行種子處理亦能減少病害的發(fā)生。B.K.Hwang等得到了Streptomyces flaveus A-11菌株產(chǎn)生的手霉素型抗生素-SW-B，這種抗生素對包括番茄早疫病菌(Alternaria solani)在內(nèi)的多種病原真菌具有很強的活性。Kim Hyun Kyum報道：在從森林和海灘土壤中分離到的300株放線菌中，篩選到1株罕見的不產(chǎn)生孢子的放線菌，其產(chǎn)生的抗生素是一種極為復雜的多聚糖聚合物，對番茄早疫病菌也有較強的抑菌活性。

1.2.2幾丁質(zhì)酶

幾丁質(zhì)酶研究通常是被放在抑菌機制的范疇內(nèi)進行的，雖然在微生物、甚至植物的體內(nèi)都提取到了具有抑菌活性的幾丁質(zhì)酶，但未見有將其用于防治的報道。幾丁質(zhì)酶經(jīng)常與β-1，3-葡聚糖酶及其他病原體相關(guān)保護蛋白協(xié)同作用，表現(xiàn)出抗菌活性，易作用于新生幾丁質(zhì)，而成熟細胞壁的幾丁質(zhì)層則不易接觸到該酶，相對較難被降解。

陶剛等測定了木霉幾丁質(zhì)酶粗酶液和純化的幾丁質(zhì)酶混合液對煙草赤星病菌孢子萌發(fā)的抑制作用，發(fā)現(xiàn)粗酶液在48 h內(nèi)強烈抑制孢子萌發(fā)和芽管伸長，或致芽管畸形和細胞壁破裂；幾丁質(zhì)酶混合液也表現(xiàn)出明顯的抑制孢子萌發(fā)的作用，但在相同或相近酶活性條件下，純化的幾丁質(zhì)酶混合液和粗酶液對赤星病菌孢子萌發(fā)的抑制率前者明顯低于后者。

1.2.3抗菌蛋白及其他

抗菌蛋白廣泛存在于植物、微生物、昆蟲及動物等生物體。已報道的抗菌蛋白和多肽大部分可抑制植物病原菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長，引起菌絲畸形、胞壁穿孔、不規(guī)則消解，導致內(nèi)含物外泄、失活。

Leifert等對枯草芽孢桿菌(B.subtilis)CL27菌株進行發(fā)酵并分離到一種對甘藍鏈格孢(A.brassicae)具有拮抗活性的寡肽。

另外，田黎等在研究海洋細菌B-9987菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)時，發(fā)現(xiàn)了一種對茄交鏈孢菌(A.sola-ni)等植物病原菌有顯著抑制作用的酚類化合物。高芬等利用漚肥浸漬液防治蘋果斑點落葉病(A.alternata)，也有一定的效果。

2、植物源制劑

植物是世界上資源豐富的生物類群之一，植物產(chǎn)生的次生代謝物質(zhì)種類繁多，已超過40萬種，其中大多數(shù)化學物質(zhì)如萜烯類、生物堿、類黃酮、甾體、酚類、獨特的拮抗蛋白和多糖等均具有殺蟲和抗菌活性。從亞麻種子、玉米種子、蕓薹科植物中分離出了各種抑菌蛋白，其分子量從5 ku到25 ku不等，能有效抑制番茄早疫病菌、甘藍鏈格孢菌的生長。從接種了TMV的煙草葉片中也提純出了抗真菌蛋白-CBP20，它與煙草的β-1，3-葡聚糖酶有協(xié)同增效作用，可抑制A.radicina和Fusarium solani的生長。國內(nèi)外在利用植物開發(fā)各類殺菌劑方面進行了不少研究，但關(guān)于植物源殺菌劑的作用機理研究還不透徹。

我國王少南、鄭毅等報道：胡椒科的山雞椒(Litsea cubeba)果實的水蒸氣粗提物、菊科的牛蒡(Arctium lappa)種子的石油醚提取物、桃金娘科的丁子香(Syzygium aromaticum)花的水蒸氣粗提物和楓香樹葉水提取液。分別對煙草赤星病菌和辣椒黑斑病菌具有抑制作用。趙玖華等測定了由四川成都恩威化工有限公司采用多種中草藥研制而成的0.3％苦·小檗堿·黃酮水劑，證明其120倍液對番茄早疫病的防治效果為67.82％。

在國外，早在1983年Singh就發(fā)現(xiàn)亞香茅精油對鏈格孢菌有一定抑菌活性。2000年又報道蕨類植物中的鞭葉鐵線蕨(Adiantum caudatum)、可食雙蓋蕨和條紋鳳尾蕨(Pteris vittata)的提取物及雞骨常山屬(Alstoniaspp.)的吲哚類生物堿能抑制甘藍鏈格孢的生長和孢子萌發(fā)。姜、大蒜、七葉樹樹皮、黑茶蔗子葉子提取物、龍葵提取液等也被報道對不同的鏈格孢屬真菌具有抑制作用。另外，植物中一些對鏈格孢屬真菌有顯著抑制作用的物質(zhì)也已被分離出來。如對A. brassicicola，A. brassicae，A.cheiranthi，A. melongenae，A. solani等的孢子萌發(fā)有抑制作用的黃連素和(+／-)一荷包牡丹堿；對F.culmorum和A.alternata有顯著抑制作用的自然雜環(huán)糖苷-巢菜堿和伴蠶豆嘧啶核苷，證實這些物質(zhì)可作為重要的自然殺真菌劑來研究。

3、誘抗劑

誘抗劑是基于病菌激發(fā)子和植物誘導抗病性原理而起防治植物病害作用的物質(zhì)。激發(fā)子是一類能誘導寄主植物產(chǎn)生防衛(wèi)反應的特殊化合物。其防衛(wèi)機制包括抗微生物的植物保衛(wèi)素的合成和積累；攻擊病原物表面多聚物的糖基水解酶的產(chǎn)生；抑制病原物降解酶的蛋白質(zhì)抑制物的合成和由于胼胝質(zhì)、富含羥脯氨酸糖蛋白或木質(zhì)素沉積而對植物細胞壁的修飾作用。激發(fā)子分生物源和非生物源兩類。

3.1激發(fā)子

病原生物或其他微生物產(chǎn)生的激發(fā)子包括真菌的β-葡聚糖、糖蛋白、脂類物質(zhì)和其他細胞壁成分。針對煙草赤星病，梁元存，商明清等用來源于煙草赤星病菌弱毒株的病菌激發(fā)子誘導煙草，產(chǎn)生了系統(tǒng)誘導抗性，苯丙氨酸裂解酶(PAL)、過氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)活性均有不同程度的增加，還可以誘導堿性PR蛋白基因的表達，PR蛋白也有量的積累。Harpin是自然界中特定的細菌性植物病原菌產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)，葛永紅等報道[463：離體試驗中harpin處理對蘋果梨采后黑斑病沒有抑制作用，經(jīng)損傷的蘋果梨用harpin溶液浸泡處理后接種鏈格孢菌，在低溫條件下貯藏可明顯降低損傷接種蘋果梨

黑斑病的發(fā)病率。

3.2病菌毒素

Kodama等認為AT毒素是煙屬植物一赤星病菌互作體系中的識別因子，只在病菌侵入、建立侵染關(guān)系的初期有決定性作用。董漢松等用赤星病菌的AT毒素脅迫體細胞，經(jīng)過不同因子誘導的抗病性通過組織培養(yǎng)向再生植株轉(zhuǎn)移，再生植株對赤星病菌的抗性明顯比原植株有所提高，而且其后代對赤星病也表現(xiàn)出抗毒素損傷、抗病菌侵入、抗病斑擴展的能力。

此外，Pedras等用蕓薹鏈格孢或其產(chǎn)生的B毒素誘導白芥產(chǎn)生了一種植保素，并分離和合成了其主要的抗菌活性成分4-羥基苯甲基硫氫酸鹽。

3.3其他物質(zhì)

誘導劑可以是各類來源不同的物質(zhì)，核黃素、殼聚糖等用于誘導接種煙草對赤星病、番茄對早疫病的抗病性反應，也都獲得了成功。

4、存在問題與展望

4.1加強研發(fā)力度，盡快推出適合市場需求的產(chǎn)品

鏈格孢菌引起的植物病害和其他病害的生物防治一樣，近年來已經(jīng)有了長足的發(fā)展，特別是煙草赤星病、番茄早疫病和十字花科黑斑病等幾類生產(chǎn)中危害嚴重的病害，生物防治的研究進展較快，但大多數(shù)生防手段和制劑的開發(fā)依然處于試驗探索階段。生物農(nóng)藥，尤其是農(nóng)用抗生素的研發(fā)雖然一直在研究中占據(jù)主導地位，但除了早期的多氧霉素(多抗霉素)外，仍未見有大面積應用的、能有效防治各類鏈格孢屬真菌病害的生物農(nóng)藥報道。近年來，一些新的農(nóng)用抗生素、拮抗菌代謝物和活體拮抗物，在前期研究中均表現(xiàn)出了良好的抑菌防病效果，具有較大的開發(fā)潛力，亟待研究者加大研發(fā)力度，盡早投放市場。

4.2利用現(xiàn)代生物技術(shù)，提高生防制劑的性能

生產(chǎn)上危害嚴重的鏈格孢屬真菌病害多為葉斑類病害，防治該類病害的生物農(nóng)藥和其他生物農(nóng)藥一樣，普遍存在見效慢、穩(wěn)定性差、藥效受環(huán)境因素影響大、使用技術(shù)要求嚴格及防治成本高等缺陷?，F(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，為提高現(xiàn)有生物農(nóng)藥的性能與產(chǎn)量，改善其成本偏高、穩(wěn)定性差等方面的不足提供了強大的技術(shù)支持。在國外，利用生物轉(zhuǎn)化和化學結(jié)構(gòu)改良技術(shù)，對已有的農(nóng)用抗生素進行結(jié)構(gòu)修飾，提高抗生素的生物活性和穩(wěn)定性，或通過基因工程手段人工構(gòu)建超量合成重要抗生素的工程菌已成為研究熱點，我國在這一領(lǐng)域的研究還處于起步階段。另外，利用基因操作技術(shù)對拮抗菌株進行遺傳改良，獲得更為高效、穩(wěn)定、安全的工程菌，也是提高生物農(nóng)藥性能的有效途徑。

4.3深入機理研究，拓寬研發(fā)途徑

防治鏈格孢屬真菌病害生防制劑的作用機理研究，除多氧霉素已明確其作用位點和機制外，大部分制劑的作用機理未能在分子或代謝水平上闡述其本質(zhì)，需要進行更深入的探索。研發(fā)防治該類病害的生物農(nóng)藥也主要以抑制病原菌和增強植物抗病性為理論基礎，而針對鏈格孢菌的主要致病因子一鏈格孢毒素的鈍化劑的開發(fā)還鮮見報道。此外，還應拓寬生防因子的獲得途徑，挖掘海洋微生物、極端環(huán)境微生物、植物各器官微環(huán)境中的非致病性微生物(特別是習居性微生物)以及各類植物等生物防治資源，并在生防菌遺傳背景、代謝機制等方面加強研究。

目前，雖然生物農(nóng)藥占整個農(nóng)藥市場的份額較小，但卻以每年10％～20％的速度上升，發(fā)展迅猛。在人類越來越關(guān)注環(huán)境質(zhì)量的今天，加強生物防治在病害控制中的應用，是病害防治的必然選擇。作為在經(jīng)濟作物上危害嚴重的鏈格孢屬真菌病害，針對其大力發(fā)展生物防治，特別是研發(fā)和應用生物農(nóng)藥所產(chǎn)生的附加值和效益必將遠遠高于化學農(nóng)藥。