周鴻雁 毛海峰 陳嘉勤

摘要：目的：研究虎紋毒素(HWTX睮)對(duì)大鼠腦缺血再灌注后腦線粒體MDA含量、SOD和GSH睵x活性的影響，探討HWTX睮的腦保護(hù)作用機(jī)制。方法：對(duì)腦缺血損傷的SD大鼠在缺血的同時(shí)蛛網(wǎng)膜下腔注射HWTX睮，再灌注24 h后測(cè)定腦線粒體MDA含量、SOD和GSH睵x活性。結(jié)果：腦缺血再灌注后大鼠腦線粒體MDA含量明顯增加，SOD、GSH睵x活性明顯降低（P＜0.05）；與生理鹽水對(duì)照組相比，HWTX睮（1ug/kg）治療組上述指標(biāo)均有明顯改善（P＜0.05）。結(jié)論：HWTX睮對(duì)缺血再灌注后腦線粒體自由基損傷有一定的保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：大鼠；HWTX睮；腦缺血再灌注；線粒體；自由基

中圖分類號(hào)：G804.7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1007-3612(2008)01-0044-03

On the Protective Function of HWTX睮 From the Damage of Rat's Cerebral Ischemia to Hindbrain's Mitochondrial Free Radical after Reperfusion

ZHOU Hong瞴an1，MAO Hai瞗eng2，CHEN Jia瞦in2

(1. Department of Physical Education of University of Arts and Sciences, Changde 415000, Hunan China;2. Academy of Physical Education, Hunan Normal University, Changsha 410081, Hunan China)

Abstract:The thesis was aimed at studying the influence of HWTX睮 on rat's hindbrain content ofmitochondrial MDA, the activities of SOD and GSH睵x after the cerebral ischemia and reperfusion. It explored HWTX睮's protective mechanism on encephalon. The methods of the research were to inject HWTX睮 on subarachnoid cavity while the SD rat which bears the damage of cerebral ischemia was still in the stage of ischemia, and to determine the content of hindbrain mitochondrial MDA and the activities of SOD and GSH睵X after it has been reperfused for twenty瞗our hours. It was shown that content of hindbrain mitochondrial MDA will be remarkably increased while the activities of SOD and GSH睵x be decreased in the same time. Compared with the salt water group, the index of HWTX睮 therapeutic group has obviously been improved. It is concluded that HWTX睮 has protective function on the damage of cerebral ischemia to the free radical of hindbrain mitochondrial after reperfusion.

Key words: rat;Huwenatoxin睮;cerebral ischemia瞨eperfusion;mitochondria;free radical

競(jìng)技體育比賽充滿激烈的對(duì)抗性和競(jìng)爭(zhēng)性，在各種體育訓(xùn)練和比賽中，遭受運(yùn)動(dòng)性創(chuàng)傷甚至引起傷殘是運(yùn)動(dòng)員經(jīng)常要面對(duì)的事實(shí)。而顱腦損傷是運(yùn)動(dòng)創(chuàng)傷中較為常見的創(chuàng)傷性疾病，嚴(yán)重的顱腦損傷會(huì)造成運(yùn)動(dòng)員中樞神經(jīng)系統(tǒng)的缺血、缺氧，引起神經(jīng)元凋亡和壞死，其致殘率和死亡率均極高。本研究試圖通過缺血性腦損傷對(duì)大鼠腦皮層組織線粒體中自由基的影響，探討HWTX-I對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中氧自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的保護(hù)作用。為HWTX-I在腦損傷中的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)對(duì)象與分組健康雄性SD大鼠32只，6月齡，體重180～250 g，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。按體重大小隨機(jī)分為A、B、C、D四組，A組為假手術(shù)組；B組為生理鹽水對(duì)照組；C組為HWTX-I高劑量組（1 ug/kg）；D組為HWTX-I低劑量組（0.5 ug/kg）。每組8只，各組分籠飼養(yǎng)，自由飲食，室溫(22±3)℃，相對(duì)濕度55%～75%。

1．2動(dòng)物模型制作模型參照改良的Pulsinelli四血管閉塞法制作全腦缺血模型^[1]。10％的水合氯醛（0.4 mL/kg，腹腔注射）麻醉，電凝雙側(cè)椎動(dòng)脈，造成永久性阻斷，同時(shí),于第一頸椎和枕骨之間蛛網(wǎng)膜下腔插管；次日，分離頸總動(dòng)脈，用無損傷的血管夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈7～15 min，造成全腦缺血模型。模型成功標(biāo)準(zhǔn)是：阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈血流后動(dòng)物立即出現(xiàn)呼吸加快、肢體痙攣、雙側(cè)瞳孔放大、痛反射消失、在10 s～1 min內(nèi)昏迷。血流復(fù)通后，動(dòng)物分別在5～10 min蘇醒。手術(shù)動(dòng)物蘇醒后表現(xiàn)為：1) 提尾后右前肢內(nèi)收屈曲;2) 爬行時(shí)向右側(cè)劃圈(“追尾現(xiàn)象");3) 站立時(shí)向右側(cè)傾倒，凡具有上述體征之一者可入選本實(shí)驗(yàn)^[2]。未昏迷或缺血后有癲癇、抽搐等并發(fā)癥的大鼠均放棄。松開血管夾后，生理鹽水對(duì)照組立即注入生理鹽水，1 ug/kgHWTX-I組、0.5 ug/kgHWTX-I組分別注入1 ug/kg、0.5 ug/kgHWTX-I。

1．3標(biāo)本制備┆所有組24 h后取材，在放置冰塊的盤中立即斷頭，迅速剪開大鼠顱骨，取出大腦組織，剪掉嗅球部分。將腦組織平均分為左右半球兩部分，取左腦用于測(cè)定。

取腦組織600 mg，SEE介質(zhì)（250 mM/L蔗糖，1g/L BSA，0.5 mM/L EDTA，0.5 mM/L EGTA，10 mM/L Hepes，PH7.4）洗殘血，用預(yù)冷的剪刀將腦組織剪碎，加入SEE介質(zhì)2.4 mL，在冰浴下勻漿2 min后，將勻漿液用SEE介質(zhì)稀釋至8 mL，離心（2 000 g×10 min），取上清液，離心（12 000 g×8 min），取沉淀；加入SEE介質(zhì)8 mL，旋渦混勻器混勻至懸浮狀態(tài)，離心（12 000 g×10 min），取沉淀，用IM介質(zhì)（0.32M蔗糖，50 mmol Tris-HCl，PH7.4）8 mL懸浮，再離心（12 000 g×10 min），取沉淀（線粒體）－80℃保存。以上操作均在0－4℃條件下進(jìn)行，并在1 h內(nèi)完成。線粒體提純后經(jīng)透射電鏡證實(shí)。

1．4指標(biāo)測(cè)定腦線粒體的蛋白含量采用考馬斯亮蘭法測(cè)定，SOD活力采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定， MDA含量采用硫代巴比妥酸法（TBA法）測(cè)定，GSH-Px活性采用DNTB顯色法測(cè)定，所有試劑為南京建成生物工程所提供的相應(yīng)試劑盒，冰醋酸為國(guó)產(chǎn)分析純。

1．5數(shù)據(jù)處理腦線粒體MDA含量、SOD和GSH-Px活性結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間差異采用方差分析法，顯著性水平為P＜0.05。所有數(shù)據(jù)均使用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。

2 結(jié)果

2.1蛛網(wǎng)膜下腔注射HWTX-I對(duì)大鼠腦線粒體MDA含量的影響┆從表1中看出,與假手術(shù)組相比,生理鹽水對(duì)照組MDA含量顯著升高(P＜0.05），說明大鼠腦缺血再灌注后過氧化脂質(zhì)在腦線粒體中堆積增多，而HWTX-I高劑量組可顯著降低其水平（P＜0.05）。運(yùn)用HWTX-I(0.5 ug/kg)，差異無顯著性。

2.2蛛網(wǎng)膜下腔注射HWTX-I對(duì)大鼠腦線粒體SOD及GSH-Px活性的影響

從表2，表3中看出，在腦缺血再灌注過程中，腦線粒體中SOD和GSH-Px活性變化呈現(xiàn)較一致的趨勢(shì)，與假手術(shù)組相比，兩者的活性均顯著降低。而HWTX-I高劑量組可顯著提高其活性（P＜0.05）。

3 討論

お

大量實(shí)驗(yàn)已證明，在缺血性腦損害進(jìn)程中，Ca²⁺介導(dǎo)現(xiàn)象起非常重要的作用。在病理情況下，如缺血，缺氧可使Ca²⁺通道開放，當(dāng)Ca²⁺過多地進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，就出現(xiàn)Ca²⁺超載，導(dǎo)致神經(jīng)元及細(xì)胞膜的損害，膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能障礙，嚴(yán)重時(shí)可使神經(jīng)元壞死^［3]。線粒體內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的失調(diào),是造成線粒體損傷的主要原因之一^[4]。Desh-pande等人發(fā)現(xiàn)，腦缺血后梗塞灶內(nèi)出現(xiàn)Ca²⁺的積累，缺血神經(jīng)元內(nèi)線粒體有Ca²⁺的沉積，Ca²⁺含量增加程度與神經(jīng)細(xì)胞的壞死數(shù)量增多相一致。 Rappaport在大鼠一側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞試驗(yàn)中，測(cè)定缺血腦組織中Ca²⁺含量，發(fā)現(xiàn)閉塞4h Ca²⁺含量明顯增加，24 h后細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺濃度比細(xì)胞外大17倍。Siesjo等將Ca²⁺平衡破壞引入腦缺血病理機(jī)制中，提出了Ca²⁺內(nèi)環(huán)境平衡的理論，線粒體和胞漿內(nèi)Ca²⁺超載是缺血性神經(jīng)細(xì)胞損傷的重要因素。Ca²⁺通道阻滯劑(Calcium Entry Blocker，CEB)是一組能夠阻止各種病理因素導(dǎo)致Ca²⁺細(xì)胞內(nèi)流的藥物。自1963年發(fā)現(xiàn)后，主要用于治療心血管疾病，而近年來，大量實(shí)驗(yàn)資料證明此類藥物對(duì)缺血性腦損傷具有保護(hù)作用。因此應(yīng)用Ca²⁺通道阻滯劑作為一種治療手段，通過阻止病理情況下的Ca²⁺超載而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，已經(jīng)成為廣泛研究的課題。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用鈣離子拮抗劑-HWTX-I，通過結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈和椎動(dòng)脈四根血管使腦組織缺血、缺氧，引起腦缺血再灌注損傷。

已知氧自由基產(chǎn)生、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、興奮性氨基酸毒性、單胺神經(jīng)遞質(zhì)毒性等可能是造成腦缺血再灌注損傷的重要因素^[5]，但大量研究證明自由基損傷是腦缺血再灌注損傷的關(guān)鍵因素。 氧自由基極易與生物膜的多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致膜的脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)破壞，膜上的酶功能受損。而自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化(lipid peroxidation)是最常見的氧化應(yīng)激性損傷^[6]。 丙二醛(MDA)作為自由基與不飽和脂肪酸反應(yīng)生成的代謝產(chǎn)物，常被用來間接反應(yīng)機(jī)體的自由基代謝的變化，它作為機(jī)體脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的主要代謝產(chǎn)物，對(duì)細(xì)胞具有嚴(yán)重的損傷作用。本實(shí)驗(yàn)觀察到，缺血再灌注大鼠腦線粒體MDA含量顯著高于假手術(shù)組，說明缺血再灌注造成的氧化性損傷使體內(nèi)產(chǎn)生大量的自由基，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)，從而進(jìn)一步加重了腦損傷；這與前人所做結(jié)果是相一致的^[7,8]。補(bǔ)充HWTX-I后，腦線粒體中MDA水平明顯降低，提示適量補(bǔ)充HWTX-I有助于減輕氧化性腦損傷。

SOD是機(jī)體內(nèi)的一種重要的抗氧化酶， 超氧自由基清除劑，對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著極其重要的作用，此酶能特異性地催化超氧陰離子自由基(O₂^-)的歧化反應(yīng)。 一般情況下，當(dāng)自由基代謝增強(qiáng)時(shí)，SOD會(huì)代償性增加。而且超氧化物歧化酶對(duì)底物顯示專一性，它能催化2個(gè)?O₂^－和2個(gè)?H+相結(jié)合形成H₂O₂。在CAT作用下H₂O₂又分解為O₂和H₂O而被清除。因而超氧化物歧化酶(SOD)活性的高低對(duì)維護(hù)線粒體自由基代謝的平衡尤為重要。它是細(xì)胞防御氧自由基的第一道屏障^[9]。

同樣，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)是生物體內(nèi)廣泛存在的一種催化過氧化物分解的酶，能特異地催化還原型谷胱甘肽(GSH)對(duì)過氧化物(如H₂O₂)的還原反應(yīng)，清除組織內(nèi)的H₂O₂的過氧化物。免除它們對(duì)生物細(xì)胞的毒害作用。這一作用對(duì)于保護(hù)生物膜及生物大分子免受自由基損傷十分重要^[10]。GSH-Px活性下降，據(jù)文獻(xiàn)資料記載，這種情況可能是由于GSH-Px活性中心的硒代半胱氨酸殘基易被自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生的多種有機(jī)氧化物所氧化，該酶的肽鏈還可以被羥自由基(OH-)裂解而失去活性。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺血再灌注大鼠腦線粒體中SOD、GSH-Px活力均顯著低于假手術(shù)組。說明在腦缺血再灌注過程中產(chǎn)生了大量的自由基，體內(nèi)抗氧化酶活性下降，自由基清除能力降低;這個(gè)結(jié)果與前人所做研究相一致： 劉學(xué)忠等報(bào)道缺血再灌注后大鼠腦組織中SOD、GSH-Px活力均顯著低于假手術(shù)組，且再灌注后6 h，活力降至最低，隨再灌注的時(shí)間延長(zhǎng)，抗氧化酶活力有逐漸升高的趨勢(shì)，但至再灌注5 d時(shí)，活力仍明顯低于假手術(shù)組^[11]。馮加純等報(bào)道了大鼠全腦缺血10 min再灌后，各腦區(qū)SOD在6 h內(nèi)迅速降至最低水平，然后逐漸回升，但在第7 d時(shí)仍低于對(duì)照水平。 補(bǔ)充HWTX-I后，SOD、GSH-Px活力均明顯升高，說明HWTX-I可通過增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化酶活力減輕腦缺血再灌注損傷。

從以上結(jié)果可見，MDA含量、GSH-Px和SOD活性三個(gè)指標(biāo)從氧化與抗氧化系統(tǒng)兩個(gè)不同方面證實(shí)了缺血性腦損傷后再灌注過程中產(chǎn)生了較多的自由基，再一次有力地支持了腦缺血后再灌注損傷的自由基學(xué)說。同時(shí)研究結(jié)果表明：在腦缺血再灌注損傷后如果能及時(shí)、適量地將HWTX-I進(jìn)行蛛網(wǎng)膜下腔給藥，能夠顯著降低大鼠腦線粒體中MDA含量，增強(qiáng)抗氧化酶能力，對(duì)腦缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。從而為缺血性腦損傷疾病的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，在臨床及理論上都具有較深遠(yuǎn)的意義。深入開展HWTX-I在腦缺血缺氧損傷性疾病治療中的研究，一方面有助于了解缺氧缺血的分子和細(xì)胞機(jī)制，更主要是為腦損傷性疾病的臨床治療尋找新的有效藥物。

4 結(jié)論

お

HWTX-I蛛網(wǎng)膜下腔用藥可以改善缺血性腦損傷對(duì)腦組織線粒體中自由基的影響，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)起保護(hù)作用。

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