摘要：從種蛋外型、胚線形態(tài)、性腺形態(tài)、分子水平、激素水平等方面對(duì)禽類早期性別鑒定進(jìn)行概迷，并就其研究進(jìn)行展望。

關(guān)鍵詞：禽；早期性別鑒定；研究進(jìn)展

中圖分類號(hào)：S814.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1007-273X(2008)05-0016-03

禽類性別的早期鑒定對(duì)禽類飼養(yǎng)管理、繁殖育種、遺傳疾病防治、種群結(jié)構(gòu)和群體遺傳分析等都具有非常重要的意義。在生產(chǎn)實(shí)踐中，尤其是在種蛋的孵化階段，這項(xiàng)技術(shù)能夠節(jié)省大量的人力、物力資源，提高養(yǎng)禽經(jīng)濟(jì)效益。但就禽類而言。要在受精前就確定其性別一般認(rèn)為是不可能的，這主要是由于禽類的精于僅為Z型配子。在成熟卵泡排卵前1～4h，卵母細(xì)胞才通過(guò)減數(shù)分裂成為含W染色體或Z染色體的配子。因此，只有卵子或晚期胚胎才可能提供有關(guān)于性別遺傳的信息。筆者將就禽類早期的性別鑒定研究作一概述，試圖通過(guò)這些技術(shù)的比較，找到一條快速、準(zhǔn)確的性別鑒定途徑。

1 禽類早期性別鑒定方法

1.1 種蛋外型鑒別法

高際生在1987年發(fā)現(xiàn)，隨著蛋型指數(shù)的增長(zhǎng)，公雛比例逐漸增大，母雛比例相應(yīng)略減；蛋重在64g以下者公雛比例稍大，以上者母雛比例略高；種蛋比重與性別之間沒(méi)有明顯的規(guī)律性關(guān)系；蛋殼細(xì)致度與性別關(guān)系不明顯。呂志南等用模糊模式進(jìn)行蛋重、蛋型指數(shù)以及蛋殼致密度的綜合來(lái)判定種蛋性別，其實(shí)際預(yù)報(bào)的正確率在93％以上。而彭秀麗等用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，探討了羅曼父母代種蛋蛋形指數(shù)與孵化率、性比例的關(guān)系，結(jié)果表明，蛋形指數(shù)為72％～77％時(shí)孵化率最高。蛋形指數(shù)與性比例無(wú)直接關(guān)系，符合遺傳規(guī)律1:1的性比例關(guān)系。但這些試驗(yàn)重復(fù)率較低，所以盛建華等認(rèn)為，蛋型指數(shù)和其性別無(wú)關(guān)。

1.2 胚線形態(tài)鑒別法

唐劍林等10在種蛋入孵3d后照蛋，發(fā)現(xiàn)雄胚主血管明顯，血管較粗，分布均勻；雌胚血管纖細(xì)，粗細(xì)均勻，分支較多，呈不規(guī)則狀(見(jiàn)圖1)。18d二照后結(jié)果表明，雞胚在孵化3d時(shí)最易鑒別。準(zhǔn)確率雌胚為89.2％，雄胚為88.5％。李振綱等采用自己研究的方法對(duì)291個(gè)雞胚蛋進(jìn)行了判別，挑出雄性胚蛋117個(gè)，把判別后的胚蛋繼續(xù)孵化，待雛雞出殼后，觀看泄殖腔進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果正確率為84％。李振剛等還從雞胚蛋血線與性別關(guān)系出發(fā)，對(duì)孵化72h的雞蛋血線進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，建立了判定雞胚性別的線性方程，其判定準(zhǔn)確率達(dá)到84.1％。

1.3 性腺形態(tài)鑒定法

一般認(rèn)為，性別決定出現(xiàn)在胚胎發(fā)育5d左右，在此前發(fā)育的性腺處于未分化階段，即在雌雄間沒(méi)有差別。從雞胚來(lái)看，其生殖脊出現(xiàn)在3.5d左右，而在5.5d才出現(xiàn)性腺分化，到7.5d或8d才可通過(guò)形態(tài)學(xué)方法檢查作出可靠的性別鑒定。所以在胚胎發(fā)育到第8天，睪丸和卵巢已經(jīng)可以通過(guò)形態(tài)進(jìn)行區(qū)別。雌性中的右側(cè)卵巢退化，導(dǎo)致卵巢兩側(cè)發(fā)育不平衡，這種現(xiàn)象可以在低倍放大鏡下觀察到；而在雄性，兩側(cè)睪丸對(duì)稱發(fā)育。這也是從形態(tài)上鑒別雌雄的一個(gè)較好的方法。

1.4 分子水平的鑒定

分子鑒定方法由于取樣少、準(zhǔn)確度高，近年來(lái)得到充分發(fā)展。

1.4.1 DNA含量鑒別法 禽類由于Z和W兩種染色體上DNA含量不同而使性細(xì)胞中DNA含量相差約2.0％(公雞基因組的DNA含量通常比母雞高2.0％左右)。并且禽的種類不同，雌雄性DNA的含量存在差異，一般在0.6％～3.5％?？衫玫饣V對(duì)雌雄性細(xì)胞進(jìn)行染色。再通過(guò)流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)細(xì)胞DNA含量來(lái)確定禽蛋性別。DELHANTY和劉凌云等曾報(bào)道了通過(guò)染色體核型分析技術(shù)進(jìn)行性別鑒定。

1.4.2 性染色體特異性DNA探針?lè)?利用W染色體DNA的核酸探針與W染色體的DNA進(jìn)行特異性結(jié)合，也是鑒定，禽類性別的一種方法。TONE等通過(guò)酶切家禽DNA獲得了W染色體上稱為XhoI家族的0.6Kb和1.1Kb的特異性片段，其中0.6Kb序列拷貝數(shù)多達(dá)1400個(gè)，為家雞所特有。隨后用類似的方法，經(jīng)EcoRI酶切消化，發(fā)現(xiàn)了第3個(gè)長(zhǎng)為1.2Kb(重復(fù)700～4000次)的重復(fù)片段。EcoRI家族和兩個(gè)Xhol家族構(gòu)成了W染色體的異染色質(zhì)區(qū)域，是鑒定W染色體的基礎(chǔ)。URYU等對(duì)雞W染色體特異的XhoI家族的重復(fù)序列進(jìn)行了克隆和測(cè)序，以帶有生物素標(biāo)記的0.7Kb重復(fù)片段的重組質(zhì)粒為探針，利用兩種雜交技術(shù)，對(duì)白來(lái)航雞進(jìn)行了性別鑒定。但染色體特異性DNA探針?lè)ㄒ话惚容^費(fèi)時(shí)，操作過(guò)程較復(fù)雜。

1.4.3 PCR鑒定法 利用PCR技術(shù)鑒定性別，靈敏準(zhǔn)確。只需微量樣品，就可以確定胚胎的性別。其中最重要的是CHDl基因和ATP5A1基因。由于在w染色體上的一些基因(CHDl基因和ATP5A1基因)或假基因序列(EE0.6序列)是非常保守的，因此可以依此進(jìn)行性別鑒定。①CHD-W基因鑒定法：CHDI基因全稱為染色體螺旋蛋白基因(Chromo-Helicase-DNA-Binding gene)。是一個(gè)定位在鳥(niǎo)類w染色體上的功能性基因，它編碼一個(gè)有關(guān)調(diào)節(jié)整個(gè)染色體水平上轉(zhuǎn)錄活性的蛋白。在非平胸鳥(niǎo)類有兩個(gè)同源拷貝CHD-W和CHD-Z，其中CHD-W為W連鎖，CHD-Z為Z連鎖，兩者的外顯子序列和大小相似，內(nèi)含子大小卻有很大差別。根據(jù)這一特性，以內(nèi)含子兩側(cè)保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，利用PCR方法對(duì)CHD-W進(jìn)行擴(kuò)增，用于多種非平胸目鳥(niǎo)的性別鑒定。利用這種方法GRIFFITHS等曾描述了利用PCR技術(shù)鑒定5～7d雞胚性別的方法。HE等利用設(shè)計(jì)的3對(duì)引物對(duì)黑天鵝CHD基因進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖電泳分析后，雌性有2條帶。而雄性只出現(xiàn)1條帶。胡銳穎等對(duì)9種86只國(guó)家一級(jí)保護(hù)鳥(niǎo)類進(jìn)行了性別鑒定。其準(zhǔn)確率高達(dá)99％。劉鑄等pq運(yùn)用CHD基因的一對(duì)引物2550F和271成功對(duì)東方白鸛(ciconia boyciana)進(jìn)行了準(zhǔn)確簡(jiǎn)便的性別鑒定，并對(duì)其序列結(jié)合其他5種遠(yuǎn)源鳥(niǎo)類相應(yīng)序列進(jìn)行分析，證實(shí)此種方法的科學(xué)性和可信性。②ATP5A1基因鑒定法：ATP5A1基因在鳥(niǎo)類W、Z染色體上以不同形式的序列出現(xiàn)，所以將染色體進(jìn)行酶切并電泳后，通過(guò)基因中被稱作PMgl的序列作為探針進(jìn)行原位雜交。會(huì)產(chǎn)生不同條帶，進(jìn)而區(qū)分性別。但此基因的保守性不是很好，在不同鳥(niǎo)類中基因序列有差異，所以在不同物種中需要不同的ATP5A1序列進(jìn)行鑒定，這增加了性別鑒定的工作量。③鳥(niǎo)類性別鑒定的通用序列鑒定法：除以上介紹的幾種方法外，利用隨機(jī)引物擴(kuò)增來(lái)鑒別雌雄的方法在國(guó)外也有報(bào)道，RAPD方法是最常用的方法。OGAWA等闡述了雞W染色體一個(gè)非重復(fù)序列的分子特性和細(xì)胞學(xué)圖譜以及利用它通過(guò)PCR廣泛鑒定非平胸鳥(niǎo)類性別的方法。楊光等選擇RAPD方法隨機(jī)擴(kuò)增出了幾種雌性鶴類共有的特異帶。較準(zhǔn)確地進(jìn)行了性別鑒定。李明等還利用朱鸚(nipponia nippon)的近緣種東方白鸛(ciconia boyciana)W性染色體上的性別相關(guān)基因PCR引物，成功擴(kuò)增出朱鸚的性別相關(guān)基因，達(dá)到了性別鑒定的目的。王利紅等根據(jù)已報(bào)道的位于家禽w染色體上保守的特異性基因片段對(duì)番鴨進(jìn)行了性別鑒定。俸艷萍等根據(jù)W染色體上特異性的0.6kb EcoR I序列和位于Z染色體上的OVR(卵黃生成受體)基因序列設(shè)計(jì)兩隊(duì)引物，利用雙重PCR法鑒定雞的性別。

1.5 激素水平鑒定法

17日齡的雞胚尿囊液中雌激素水平可以通過(guò)RIA(放射免疫)試劑進(jìn)行檢測(cè)。在雌胚的尿囊液中，其雌激素含量水平為113～830pg/mL，至少是雄胚含量的3倍。研究表明，雌激素是進(jìn)行雞胚性別鑒定的理想指標(biāo)。美國(guó)Embrex公司(www，embrex，com)在此方面處于領(lǐng)先地位，已申請(qǐng)兩項(xiàng)專利(專利號(hào)分別為6506570和6510811)，前者是測(cè)定蛋內(nèi)尿囊液方法的專利，包括收集、定位尿囊液，使它可以被穩(wěn)定地取樣。后者是測(cè)定性激素水平的專利，如測(cè)定禽蛋中雌激素水平升高即表示即將孵出的是母雞。該公司已在進(jìn)行深入研究并開(kāi)展商業(yè)化試驗(yàn)，試圖設(shè)計(jì)出首個(gè)測(cè)定雞胚尿囊液中雌激素的自動(dòng)模型。

1.6 其他的鑒定方法

肖天放等對(duì)番鴨在孵化期前10d的7個(gè)不同溫度進(jìn)行試驗(yàn)顯示：不同孵化溫度下出殼的雛番鴨公母性別存在明顯的差異，公雛率隨孵化溫度的升高而升高，母雛率隨孵化溫度的升高而下降。雛番鴨第二性比(♂:♀)與孵化前期溫度間的相關(guān)系數(shù)為0.99。王利紅等采用兩種類型的芳香化酶抑制劑處理孵化7d的番鴨種蛋，結(jié)果顯示，兩種抑制劑均可以在一定程度上誘導(dǎo)番鴨性別雄性化作用，其轉(zhuǎn)化率分別為87.5％和86.7％，與對(duì)照組(46.1％)差異顯著。王光瑛等用3種處理方法對(duì)番鴨胚蛋進(jìn)行處理，結(jié)果顯示：芳香化酶抑制劑處理組極顯著提高雄性比例(P＜0.01)。且對(duì)種蛋受精率和孵化率無(wú)不良影響。

2 禽類早期性別鑒定展望

禽類早期的性別鑒定主要分為蛋殼外鑒定和蛋內(nèi)容物的鑒定。前者如種蛋外型、胚線形態(tài)、性腺形態(tài)、溫度、芳香化酶抑制劑等方法。后者如分子方法、激素方法。這些方法的應(yīng)用均取得了一些較好的成績(jī)。例如在對(duì)17日齡的雞胚鑒定，中，測(cè)定尿囊液中的雌激素顯然已經(jīng)能使性別在孵化的中期就能得到確認(rèn)。利用胚胎血線與性比的關(guān)系建立方程的方法，這種方法由于鑒別方法較為簡(jiǎn)單容易操作，而且鑒別時(shí)間較早。不破壞種蛋，不影響孵化。DNA鑒定尤其是CHD-W基因鑒定法，其操作簡(jiǎn)便。周期短，大量樣品可以同時(shí)檢測(cè)，更為重要的是通過(guò)雙陽(yáng)性結(jié)果來(lái)判斷雌雄，排除了假陰性的可能性，確保了結(jié)果的可靠性。然而，這些方法也有缺陷，如種蛋外型、胚線形態(tài)等方法其鑒定的準(zhǔn)確性有待提高，可能是由于禽的種類、飼養(yǎng)管理及所處環(huán)境、處理方法等差異引起。分子方法、激素法都需要采集一定量的測(cè)定樣品，盡管通過(guò)核磁共振成像技術(shù)(MRI)已能較為準(zhǔn)確的定位胚盤(pán)，但還沒(méi)有一種很好的方法可以在打開(kāi)蛋殼并在不影響后繼孵化的前提下采集樣品。Embrex公司的研究專利盡管解決了性別的鑒定問(wèn)題，但由于是對(duì)孵化17日齡左右的胚蛋進(jìn)行性別鑒別，其對(duì)于更早期的性別鑒定貢獻(xiàn)有限。因此禽類的早期性別鑒定相對(duì)于哺乳動(dòng)物較難。但是，禽類的早期性別鑒定還可以考慮從以下幾個(gè)方面進(jìn)行：①盡管在禽類受精前識(shí)別其性別很難實(shí)現(xiàn)，但是否可以通過(guò)對(duì)精于進(jìn)行某些處理以使其能夠特異性的識(shí)別W型配子或通過(guò)對(duì)母禽進(jìn)行相關(guān)的處理以使其在特定條件下只產(chǎn)生W型配子。②環(huán)境條件在一定程度上影響性別的形成。能否通過(guò)進(jìn)一步的研究確定控制性別的準(zhǔn)確條件。③早期性別鑒別能否在不打開(kāi)蛋殼的基礎(chǔ)上(如通過(guò)B超)利用其他的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。