摘要 離體條件下測(cè)定并比較了10種殺菌劑對(duì)番茄早疫病菌、蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌、梨黑斑病菌、煙草赤星病菌和甘藍(lán)黑斑病菌等5種鏈格孢屬植物病原真菌的抗菌活性。結(jié)果表明，不同種的鏈格孢屬病菌對(duì)同一藥劑的敏感性相近；咪鮮胺、啶菌惡唑、苯醚甲環(huán)唑、異菌脲、腐霉利等5種殺菌劑對(duì)供試病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性最好，其EC₅₀在0.01～1.28ug/mL之間；百菌清對(duì)病菌分生孢子萌發(fā)的抑制活性最高，其次是醚菌酯和嘧菌酯。

關(guān)鍵詞 殺菌劑；鏈格孢屬病菌；菌絲生長(zhǎng)；孢子萌發(fā)

中圖分類號(hào) S482.2

鏈格孢屬(Alternaria Nees)真菌是重要的植物病原菌屬之一，除少數(shù)種可侵染人和動(dòng)物，引起皮癬、甲癬、顎骨髓炎等疾病外，大多數(shù)種可寄生于植物引起包括玉米、小麥、煙草、馬鈴薯、番茄、蘋(píng)果、梨、甘藍(lán)、人參等的幾十種植物病害。這類病菌的代謝產(chǎn)物即毒素可導(dǎo)致受害植物產(chǎn)生各種癥狀，如黑斑病、褐斑病、莖枯病、赤星病等，嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)了巨大損失。過(guò)去應(yīng)用較多的苯并咪唑類殺菌劑如多菌靈等對(duì)這類病害的防效通常較差或無(wú)效，市場(chǎng)上專門(mén)用于防治這類病害的藥劑品種較少，給生產(chǎn)上選擇防治這類病害的藥劑帶來(lái)困難。

本文測(cè)定并比較了10種殺菌劑對(duì)5種常見(jiàn)鏈格孢屬病菌的離體抗菌活性，旨在了解這些藥劑對(duì)鏈格孢屬真菌的活性，以及這些藥劑對(duì)鏈格孢屬病菌的作用特點(diǎn)，從而為生產(chǎn)上防治這類病害時(shí)科學(xué)用藥以及企業(yè)開(kāi)發(fā)混配藥劑提供理論參考。

1 材料與方法

1．1 供試病菌

番茄早疫病菌(Alternaria solani)、蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌(A.mali)、甘藍(lán)黑斑病菌(A.brassicae)、梨黑斑病菌(A.kikuchiana)、煙草赤星病菌(A.lon-gipes)，均為本研究室保存菌種。

1．2 供試藥劑

試驗(yàn)藥劑為95.4％醚菌酯(kresoxim-methyl)原藥(江蘇耕耘化學(xué)有限公司)、98.1％腐霉利(pro-cymidone)原藥(浙江禾益農(nóng)化有限公司)、98.2％多菌靈(carbendazim)原藥(江蘇蘇化集團(tuán)新沂農(nóng)化有限公司)、25％嘧菌酯(azoxystrobin)懸浮劑(先正達(dá)公司)、96％異菌脲(iprodione)原藥(江蘇蘇化集團(tuán)新沂農(nóng)化有限公司)、95％三唑酮(triadimefon)原藥(江蘇蘇化集團(tuán)新沂農(nóng)化有限公司)、99.3％咪鮮胺(prochloraz)原藥(樂(lè)斯化學(xué)有限公司)、95.2％苯醚甲環(huán)唑(difenoconazole)原藥(江蘇耕耘化學(xué)有限公司)、84％啶菌惡唑(SYP-Z048)EC(沈陽(yáng)化工研究院)、98％百菌清(chlorothalonil)原藥(江蘇寶靈化工有限公司)。除將25％嘧菌酯SC溶于無(wú)菌水外，其余原藥均溶于丙酮中制成適當(dāng)濃度的母液保存于4℃冰箱中備用。

1．3 供試病菌的培養(yǎng)及孢子懸浮液的制備

1．3．1 供試病菌的預(yù)培養(yǎng)

將5種供試病菌在馬鈴薯蔗糖瓊脂(PSA)平板上，(25±1)℃下黑暗培養(yǎng)，待菌落邊緣接近皿壁時(shí)，即可打取菌餅用于試驗(yàn)。

1．3．2 供試病菌孢子懸浮液的制備

將4種供試病菌番茄早疫病菌、甘藍(lán)黑斑病菌、梨黑斑病菌、煙草赤星病菌在PSA平板上，(25±1)℃、12 h∥12 h(D∥L)光照條件下培養(yǎng)8 d后，向培養(yǎng)皿中加入10 mL無(wú)菌水，用無(wú)菌曲玻棒輕輕洗下菌落中的分生孢子，盡量減少菌絲斷裂。兩層無(wú)菌紗布過(guò)濾得到分生孢子懸浮液，在顯微鏡下(10×10倍)檢查孢子數(shù)，平均每視野60～100個(gè)孢子即可。

1．4 藥劑敏感性測(cè)定方法

1．4．1 供試藥劑對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

采用平皿菌絲生長(zhǎng)抑制法測(cè)定供試藥劑對(duì)各病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性，即在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇各藥劑對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)抑制率在10％～90％范圍內(nèi)的5個(gè)濃度；將配制好的供試藥劑母液按照設(shè)定的濃度比例加入到已融化并冷卻至50℃左右的PSA培養(yǎng)基中，充分混勻后分別倒入3個(gè)滅菌的培養(yǎng)皿中，制成系列濃度的含藥PSA平板，以不加藥劑但含等量溶劑的PSA平板為對(duì)照。用直徑為6 mm的打孔器在預(yù)培養(yǎng)的菌落邊緣的同一圓周上打取菌餅，菌絲面朝下接種到含藥培養(yǎng)基平板中央，置于(25±1)℃下黑暗培養(yǎng)，待對(duì)照的菌落邊緣接近皿壁時(shí)用十字交叉法測(cè)量各處理的菌落直徑，并求出3次重復(fù)的平均值，得出各處理的平均菌落增長(zhǎng)直徑(一平均菌落直徑-6mm)，并計(jì)算各藥劑處理對(duì)病菌的菌絲生長(zhǎng)抑制率。

抑制率＝[對(duì)照的菌落增長(zhǎng)直徑(mm)-處理的菌落增長(zhǎng)直徑(mm)]/[對(duì)照的菌落增長(zhǎng)直徑(mm)]×100％。

以試驗(yàn)中設(shè)定的濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)(z)，抑制率幾率值為縱坐標(biāo)(y)，求出各藥劑對(duì)供試病菌的毒力回歸曲線方程y=a+bx、相關(guān)系數(shù)r以及有效抑制中濃度(EC₅₀)。最后根據(jù)EC₅₀值，分析比較不同殺菌劑對(duì)供試病菌菌絲生長(zhǎng)的影響。

1．4．2 供試藥劑對(duì)4種病菌分生孢子萌發(fā)的影響

采用瓊膠平板法測(cè)定藥劑對(duì)病菌分生孢子萌發(fā)的影響。將各藥劑分別加入到滅菌冷卻至50℃左右的水瓊膠培養(yǎng)基(瓊脂2％，蔗糖1％)中，制成濃度為1 mg/L、10 mg/L、100 mg/L的帶毒瓊膠平板，并設(shè)不加藥劑的瓊膠平板為對(duì)照。待瓊膠平板完全凝固后，以移液槍取200#L孢子懸浮液加入平板中，用曲玻棒涂抹均勻，置于(25±1)℃下黑暗培養(yǎng)10～12 h。待對(duì)照孢子萌發(fā)率超過(guò)90％以上時(shí)，在顯微鏡下(10×10倍)檢查各處理平板孢子萌發(fā)數(shù)，每處理計(jì)數(shù)200個(gè)以上孢子。與空白對(duì)照比較計(jì)算各藥劑對(duì)病菌分生孢子萌發(fā)的抑制率，分析比較不同殺菌劑對(duì)供試病菌分生孢子萌發(fā)的影響。

2 結(jié)果與分析

2．1 對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

供試10種藥劑對(duì)5種鏈格孢屬病原真菌菌絲生長(zhǎng)的毒力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1，從表中可見(jiàn)，異菌脲、腐霉利、咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑、啶菌惡唑等5種藥劑對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性均較高，除異菌脲對(duì)番茄早疫病菌的EC₅₀為1.28ug/mL外，其余EC₅₀均小于1ug/mL，且這些藥劑對(duì)不同種的鏈格孢屬病菌的活性差異較小，EC₅₀均相差在5倍以內(nèi)。此外，結(jié)果也表明生產(chǎn)上應(yīng)用較多的苯并咪唑類殺菌劑多菌靈對(duì)這類病菌的活性較差，EC₅₀均大于100 ug/mL。盡管三唑酮、咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑等均為病菌麥角甾醇生物合成抑制劑，但它們對(duì)鏈格孢屬病菌的活性存在差異，后兩種藥劑均表現(xiàn)出了較高的活性。

2．2 對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

由于本研究所用蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌菌株的分生孢子產(chǎn)生量較低，因此僅測(cè)定了其余4種鏈格孢屬真菌的分生孢子萌發(fā)對(duì)10種藥劑的敏感性。結(jié)果表明(表2)，不同藥劑對(duì)同一種鏈格孢真菌分生孢子萌發(fā)的抑制活性不同，但同一藥劑對(duì)不同種鏈格孢病菌的活性相近。在藥劑濃度為100ug/mL時(shí)，百菌清對(duì)4種供試病菌分生孢子萌發(fā)的相對(duì)抑制率達(dá)到了94.28％～100％，抑制作用最強(qiáng)，其次是醚菌酯(78.02％～91.79％)、嘧菌酯(78.04％～89.95％)、啶菌惡唑(69.50％～88.39％)、腐霉利(68.00％～85.72％)，抑制作用較低的殺菌劑有異菌脲(48.70％～73.79％)、咪鮮胺(14.72％～75.63％)、苯醚甲環(huán)唑(15.45％～51.93％)，抑制作用最低的殺菌劑有三唑酮(1.74％～20.84％)和多菌靈(5.67％～12.35％)。在藥劑濃度為10ug/mL時(shí)，除百菌清、醚菌酯、嘧菌酯、啶菌惡唑4種殺菌劑仍具有較高的相對(duì)抑制率外，其余6種殺菌劑的相對(duì)抑制率均低于25％。在藥劑濃度為1/ug/mL時(shí)，百菌清對(duì)4種供試病菌分生孢子的萌發(fā)仍有80％以上的相對(duì)抑制率，醚菌酯和嘧菌酯則具有20.01％～52.09％的相對(duì)抑制率，啶菌惡唑僅有11.00％～25.23％的相對(duì)抑制率。

3 討論

本文所選用的5種供試植物病原菌所致病害均是生產(chǎn)上發(fā)生普遍、危害嚴(yán)重的鏈格孢屬病菌，如番茄早疫病又稱輪紋病，全國(guó)各地普遍發(fā)生，是番茄重要病害之一，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)引起落葉、落果和斷枝，對(duì)產(chǎn)量影響很大，常年減產(chǎn)20％～30％，嚴(yán)重時(shí)達(dá)50％以上，甚至絕產(chǎn)；煙草赤星病是煙葉成熟后期重要的葉部病害，是煙草生產(chǎn)上威脅最大的病害之一，對(duì)煙草的產(chǎn)量和品質(zhì)均造成嚴(yán)重影響，自1892年首次報(bào)道煙草赤星病以來(lái)，曾幾次給世界煙葉生產(chǎn)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)這類病害的防治目前均缺乏有效的抗病作物品種，主要依賴于化學(xué)藥劑進(jìn)行防治，過(guò)去防治此類病害使用的藥劑主要有二硫代氨基甲酸酯類、芳烴類、二甲酰亞胺類等，常見(jiàn)的品種如代森錳鋅、百菌清、菌核凈、異菌脲、腐霉利等，但這些藥劑防治效果較好，治療效果差，而且這些殺菌劑已經(jīng)使用了十幾年甚至幾十年，有些品種的施用量已經(jīng)達(dá)到原有用量的數(shù)倍，抗藥性問(wèn)題嚴(yán)重，這不僅提高了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，而且由于過(guò)量用藥導(dǎo)致環(huán)境污染嚴(yán)重，危害生物安全。因此，研究使用新型高效、廣譜、作用機(jī)理不同、結(jié)果新穎的殺菌劑以及科學(xué)合理使用現(xiàn)有藥劑防治這類病害是生產(chǎn)上亟待解決的問(wèn)題。

本研究表明，同一藥劑對(duì)不同種類的鏈格孢屬植物病菌的活性相近，因此，生產(chǎn)上在選擇藥劑防治此類病害時(shí)可相互借鑒用藥方案，但不同種的鏈格孢病菌由于用藥歷史和防治水平的差異，其抗藥性發(fā)生狀況也不盡相同。結(jié)果表明苯并咪唑類的多菌靈無(wú)論對(duì)菌絲生長(zhǎng)還是孢子萌發(fā)的活性均較低；百菌清雖然對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制活性較差，但對(duì)孢子萌發(fā)的抑制活性高，其為多作用位點(diǎn)保護(hù)性殺菌劑，使用多年來(lái)未出現(xiàn)抗藥性問(wèn)題，建議與其他高效內(nèi)吸性藥劑混配使用防治這類病害；異菌脲和腐霉利均為二甲酰亞胺類殺菌劑，均對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制活性較高，但對(duì)孢子萌發(fā)的抑制作用較低，且內(nèi)吸性較差，抗性風(fēng)險(xiǎn)較高；三唑酮、咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑等均是麥角甾醇生物合成抑制劑，均對(duì)孢子萌發(fā)的抑制活性較差，但后面兩種藥劑對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制活性較高；啶菌惡唑是我國(guó)自主研制的新穎結(jié)構(gòu)殺菌劑，對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制活性較高，對(duì)孢子萌發(fā)也有一定的抑制活性；醚菌酯和嘧菌酯為甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，均是新近開(kāi)發(fā)的線粒體呼吸抑制劑，對(duì)病菌孢子萌發(fā)活性較高，但由于在離體培養(yǎng)基平板上沒(méi)有抑制病菌旁路呼吸代謝途徑的物質(zhì)，因此降低了其對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制活性，而在植物體內(nèi)存在抑制旁路氧化酶(AOX)的(類)黃酮類物質(zhì)，因此在植物活體上的活性較高，已有報(bào)道其在防治番茄早疫病及蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病具有優(yōu)良的防治效果，但已有報(bào)道病菌對(duì)甲氧基丙烯酸酯類藥劑產(chǎn)生了抗性問(wèn)題。因此，生產(chǎn)上可根據(jù)這些藥劑的活性和作用特點(diǎn)，輪換或混配使用用于鏈格孢屬真菌病害的防治，以達(dá)到理想的防治效果，并能延長(zhǎng)這些藥劑的使用壽命。