摘要 本研究選取辣椒輕斑駁病毒PMMoV、煙草花葉病毒TMV、黃瓜花葉病毒CMV和馬鈴薯Y病毒PVY作為試驗(yàn)材料，根據(jù)PMMoV衣殼蛋白(CP)RNA的序列特異性位點(diǎn)，設(shè)計(jì)出Taqman熒光探針及其引物，采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)對(duì)PMMoV進(jìn)行快速檢測(cè)，同時(shí)與ELISA方法進(jìn)行了靈敏度比較，結(jié)果表明：該方法具有較高的靈敏度及較強(qiáng)的特異性，PMMoV檢測(cè)結(jié)果為陽性，TMV、CMV和PVY均無熒光信號(hào)，為陰性，靈敏度是傳統(tǒng)的ELISA方法的100倍，而且大大縮短了檢測(cè)時(shí)間。該方法快速、準(zhǔn)確、靈敏、簡(jiǎn)便、安全，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，適用于植物病毒病害的快速檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 辣椒輕斑駁病毒；實(shí)時(shí)熒光RT-PCR；雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法

中圖分類號(hào) S436.418.12

甜(辣)椒(Capsicum sp．)廣泛栽培于世界各地，是重要的蔬菜之一。辣椒輕斑駁病毒(Peppermild mottle virus，PMMoV)是甜椒上一種危害嚴(yán)重的病毒，PMMoV在很多國(guó)家都有報(bào)道。在美國(guó)、日本、英國(guó)等國(guó)家，該病造成感病辣椒葉片褪綠，果實(shí)小、斑駁和畸形，早期發(fā)病植株嚴(yán)重矮化等癥狀，在英國(guó)、日本保護(hù)地和美國(guó)一些地區(qū)辣椒上曾造成毀滅性危害。PMMoV屬于煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)，病毒粒子桿狀，為單組分正單鏈RNA病毒(+ssRNA)，編碼4個(gè)蛋白，即與病毒復(fù)制有關(guān)的126kDa、183kDa蛋白、移動(dòng)蛋白(MP)和衣殼蛋白(CP)。該病毒可以種傳和汁液摩擦傳毒，介體不易傳毒，帶毒種子和感病植株是重要的侵染源。在我國(guó)該病毒少有報(bào)道，1994年向本春首次報(bào)道新疆辣椒上發(fā)現(xiàn)了辣椒輕斑駁病毒，譚根堂等在2003年報(bào)道了陜西線辣椒上病毒病優(yōu)勢(shì)毒原是PMMoV、CMV、蠶豆萎蔫病毒(BBWV)；2003年李明福等報(bào)道了引進(jìn)的一辣椒新品種由于辣椒輕斑駁病毒在種植棚內(nèi)暴發(fā)嚴(yán)重病害；2004年黃粵等用RT—PCR方法在山東青島檢測(cè)到辣椒輕斑駁病毒；2005年李興紅等報(bào)道在北京、寧夏兩地田間甜椒上檢測(cè)到辣椒輕斑駁病毒。2005年陳青等在進(jìn)境辣椒種子中檢出辣椒輕斑駁病毒。

病毒可以存活于種子的種皮、胚或胚乳內(nèi)，有統(tǒng)計(jì)表明約10％的植物病毒被認(rèn)為是可以通過種子傳播的。病毒隨感染的種子遠(yuǎn)距離調(diào)運(yùn)傳播，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前文獻(xiàn)報(bào)道用于檢測(cè)辣椒輕斑駁病毒的方法有：電鏡檢測(cè)法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和分子生物學(xué)檢測(cè)方法(RT-PCR)。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法是近年來發(fā)展起來的一種能有效縮短檢測(cè)時(shí)間、提高檢測(cè)靈敏度及準(zhǔn)確度的新方法，廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物病害的檢測(cè)。本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測(cè)甜(辣)椒種子，能夠快速靈敏地檢測(cè)出其中的PMMoV，對(duì)預(yù)防該病毒隨種子遠(yuǎn)距離傳播有重要意義。建立種子中辣椒輕斑駁病毒快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，對(duì)進(jìn)出口種子檢驗(yàn)檢疫、病毒病害防治預(yù)測(cè)具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1．1 供試材料

選擇自然侵染甜椒的4種病毒CMV、TMV、PVY、PMMoV作為研究對(duì)象，其中PMMoV的2個(gè)分離物均來源于茄門甜椒，經(jīng)分離純化后分別保存在健康的甜椒上。本實(shí)驗(yàn)室保存在普通煙上的TMV、枯斑三生煙上的CMV及克利夫蘭煙上的PVY?；铙w保存的植株葉片經(jīng)DAS-ELISA檢測(cè)分別呈PMMoV、TMV、CMV、PVY陽性。甜椒是這4種病毒的自然寄主。

本實(shí)驗(yàn)室保存的PMMoV衣殼蛋白基因部分克隆質(zhì)粒為陽性對(duì)照，健康的甜椒葉片(DAS—ELISA檢測(cè)呈陰性)作為陰性對(duì)照。

1．2 儀器及試劑

1．2．1 儀器

ABIT000實(shí)時(shí)熒光PCR儀(美國(guó)ABI公司)，5417R臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)，德國(guó)R302DT71K4-2原葉榨汁機(jī)，美國(guó)TE-CAN公司的SUNRISE酶聯(lián)儀和洗板機(jī)。

1．2．2 試劑

熒光PCR：5×real-time PCR buffer(Mg²+free)、dNTP(s)(10 mmol/L)、MgCl₂(250 mmol/L)、ExTaq DNA聚合酶(5 U/uL)，AMV反轉(zhuǎn)錄酶(5 U/uL)、Rnase inhibitor(40 U/uL)購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)。

RNA提取試劑盒購(gòu)于北京佰億新創(chuàng)科技有限公司(BioFlux)。4種病毒的酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Agdia公司。引物和探針由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1．3 試驗(yàn)方法

1．3．1 探針及引物的設(shè)計(jì)與合成

GenBank中查詢并下載4種病毒衣殼蛋白核酸序列，并進(jìn)行序列比對(duì)，根據(jù)PMMoV共同的衣殼蛋白特異序列設(shè)計(jì)TaqMan熒光探針及其引物，序列如下：探針P 5’-TGTCGGCACTTCTCG-GAGCCTTTG-3’，探針5’末端標(biāo)記報(bào)告熒光染料6-FAM，3’末端標(biāo)記淬滅熒光染料TAMRA，上游引物F 5’-TTAGATTTCCTGCTACTG-GTTTCAA-3’，下游引物R 5’-CAGTTGTAG-GATTTTGCGGATTT-3’。

1．3．2 病毒RNA的提取

按照RNA提取試劑盒說明書的步驟提取RNA。

1．3．3 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

在反應(yīng)管中加dNTP(2.5 mmol/L)8uL、Rnaseinhibitor(40 U/uL)1 uL、5×AMV Buffer 4uL、AMV(5 U/uL)2 p.L、下游引物R(20/umol/L)uL、RNA模板1uL，加DEPC處理水使總體積為20 uL，混勻，室溫放置10 min，42℃水浴30 min，0℃冷卻2 min，合成cDNA。

1．3．4 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)

1．3．4．1 反應(yīng)體系

5×real-time PCR Buffer(Mg²⁺。free)5 uL、dNTP(s)(10 mmol/L)0.5uL、MgCl₂(250 mmol/L)0.25uL、ExTaq HS DNA聚合酶(5 U/uL)0.25uL、引物(20umol/L)各0.7uL，探針(20umol/L)0.3uL，eDNA模板1uL，加滅菌雙蒸水使總體積為25uL。試驗(yàn)選取采集的兩個(gè)PMMoV分離物作為檢測(cè)對(duì)象，添加滅菌雙蒸水作為陰性對(duì)照，以監(jiān)測(cè)試驗(yàn)過程的環(huán)境污染。

1．3．4．2 樣本檢測(cè)

將樣品放入ABI 7000反應(yīng)板上，打開電腦、儀器電源和軟件，設(shè)置PCR反應(yīng)條件：95℃5 min，然后95℃15 s，60℃1 min，45個(gè)循環(huán)。熒光PCR反應(yīng)約2 h結(jié)束，保存文件。

1．3．5 靈敏度測(cè)試

1．3．5．1 DAS-ELISA檢測(cè)的靈敏度測(cè)試

將0.1 g感染PMMoV的辣椒葉片榨汁，用抽提緩沖液SEBl稀釋汁液10×、10²×、10³×、10⁴×、10⁵×共5個(gè)濃度梯度，參照DAS-ELISA檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，加入底物后避光放置15 min用酶聯(lián)儀測(cè)定405 nm下的吸光值并觀察顏色變化。

1．3．5．2 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的靈敏度測(cè)試

從0.1 g感染PMMoV的辣椒葉片中提取的RNA依次稀釋10×、10²×、10³×、10⁴×、10⁵×共5個(gè)濃度梯度，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2．1 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)

PMMoV毒源保存在甜椒上的葉片、感染TMV的普通煙葉片、感染CMV的枯斑三生煙葉片、感染PVY的克利夫蘭煙葉片以及從健康甜椒上采集的葉片提取RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為模板，用于實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)。打開分析軟件，儀器自動(dòng)分析試驗(yàn)結(jié)果，給出ARn(第n個(gè)循環(huán)時(shí)的熒光增加值)與循環(huán)數(shù)圖像。反應(yīng)結(jié)果表明：從檢測(cè)的克隆PM-MoV衣殼蛋白基因質(zhì)粒、從感染PMMoV，的葉片材料收集到強(qiáng)的熒光信號(hào)，C_t值為22～25，表現(xiàn)為陽性擴(kuò)增，相同寄主上的其他病毒TMV、CMV、PVY以及健康甜椒和水對(duì)照均無熒光信號(hào)增加，表現(xiàn)為陰性(圖1)，說明此探針及引物組合對(duì)PMMoV具有的特異性。

2．2 靈敏度試驗(yàn)

對(duì)辣椒葉片汁液稀釋10×、10²×、10³×，經(jīng)DAS-ELISA檢測(cè)結(jié)果均為陽性，對(duì)10⁴×、10⁵×稀釋的汁液檢測(cè)結(jié)果為陰性，檢測(cè)時(shí)間需要兩個(gè)工作日才能完成。實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果表明：當(dāng)RNA稀釋到10⁵×?xí)r，實(shí)時(shí)熒光PCR仍能檢測(cè)到(圖2)。結(jié)果表明實(shí)時(shí)熒光PCR法比DAELISA檢測(cè)方法更靈敏，該實(shí)時(shí)熒光PCR法的建立將靈敏度由傳統(tǒng)的DAELISA至少提高了100倍，而且由樣品處理到獲得試驗(yàn)結(jié)果僅需約3/5個(gè)工作日

3 結(jié)論與討論

辣椒輕斑駁病毒是甜椒上的一種重要病害，種子帶毒是遠(yuǎn)距離傳播的重要途徑。用于病毒檢測(cè)的生物學(xué)方法檢測(cè)需時(shí)長(zhǎng)，且需要大量的鑒別寄主；采用電子顯微鏡方法檢測(cè)需要昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器且需配備專業(yè)的技術(shù)人員；應(yīng)用血清學(xué)方法檢測(cè)容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果；應(yīng)用普通PCR技術(shù)檢測(cè)需要進(jìn)行反應(yīng)后的EB染色處理，接觸易致癌且污染環(huán)境；采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)具有簡(jiǎn)便快捷，特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)，又由于整個(gè)過程無需對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行后期處理，可以有效防止檢測(cè)過程中的污染及假陽性，大大提高了檢測(cè)速度，因此實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)目前被認(rèn)為是植物病原鑒定和病害診斷的革命性方式，將很快成為植物病害診斷中新的可靠方法。

本試驗(yàn)根據(jù)辣椒輕斑駁病毒衣殼蛋白區(qū)域編碼序列，與侵染同寄主的其他病毒進(jìn)行比較，設(shè)計(jì)了辣椒輕斑駁病毒的特異TaqMan熒光探針，從檢測(cè)結(jié)果上可以看出只有感染辣椒輕斑駁病毒的樣本進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)呈陽性，而煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒、馬鈴薯Y病毒的熒光PCR檢測(cè)都呈陰性，說明設(shè)計(jì)的探針具有很好的特異性，所建立辣椒輕斑駁病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法靈敏度高，是DAELISA法的100倍，同時(shí)大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，實(shí)現(xiàn)了對(duì)辣椒輕斑駁病毒的靈敏、簡(jiǎn)便、快速檢測(cè)，能夠很好地滿足種傳病害的快速診斷和進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫的需要。